Análisis de redes de genes para la identificación de biomarcadores de microARN para el asma

by | Dic 27, 2022 | 0 comments

Abstracto

Antecedentes

Hasta la fecha, no se han identificado biomarcadores fiables para el asma. Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que regulan negativamente la expresión génica postranscripcional y están implicados en diversas enfermedades, incluida el asma. Los miARN pueden servir como biomarcadores ideales debido a su capacidad para regular múltiples vías. Este estudio tiene como objetivo identificar las firmas de biomarcadores de miARN para el asma.

Métodos

Utilizamos el modelo de ratón de inflamación alérgica del ácaro del polvo doméstico (HDM). Los ratones fueron fenotipados mediante la evaluación de la función pulmonar, la respuesta alérgica, la inflamación de las vías respiratorias y la remodelación. Los perfiles característicos de miARN en suero y tejido pulmonar se determinaron mediante secuenciación de ARN pequeño y los datos se analizaron con Qiagen CLC Genomics Workbench. Para identificar objetivos de genes relevantes, realizamos la secuenciación de ARNm, seguida de un análisis de objetivos de miARN. Estos miARN y dianas se sometieron a análisis funcionales y de vías posteriores.

Resultados

Los ratones expuestos a HDM desarrollaron características fenotípicas de asma alérgica. El análisis de secuenciación de miARN mostró que 213 miARN estaban sustancialmente desregulados (valor p de FDR < 0,05 y expresión de cambio de pliegue > + 1,5 y < - 1,5) en el pulmón de ratones HDM en relación con los ratones de control. Por el contrario, solo un miARN (miR-146b-5p) aumentó significativamente en el suero. El análisis de objetivos de los miARN desregulados en los pulmones reveló un total de 131 miARN dirigidos a 211 ARNm. El análisis de la ruta mostró que el ayudante T 2/1 (Th2/Th1) era la principal ruta de señalización significativamente activada asociada con los miARN desregulados. Las principales enfermedades enriquecidas fueron la respuesta inflamatoria y la enfermedad, que incluía el asma. El análisis de redes de asma indicó que 113 de 131 miARN estaban directamente asociados con la patogénesis del asma.

Conclusiones

Estos hallazgos sugieren que la mayoría de los miARN desregulados en el modelo HDM se asociaron con la patogénesis del asma a través de la señalización Th2. Identificamos un panel de 30 miARN como candidatos potenciales a biomarcadores para el asma.

Introducción

El asma es una enfermedad inflamatoria crónica prevalente de las vías respiratorias que afecta a más de 300 millones de personas en todo el mundo y a 25 millones de personas en los Estados Unidos. [1]. Se caracteriza por hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR), remodelación e hiperplasia e hipertrofia de las células del músculo liso. [2]. El asma se clasifica en múltiples fenotipos y endotipos, que incluyen alérgico, eosinofílico y neutrofílico, siendo el asma alérgica el subtipo más prevalente. [3]. La heterogeneidad en el origen de la inflamación contribuye a los desafíos para encontrar un tratamiento eficaz y no existe cura ni biomarcadores específicos para el asma. Por lo tanto, identificar biomarcadores confiables para predecir la patogénesis de la enfermedad llenaría un vacío en nuestro conocimiento que podría ser útil en el desarrollo terapéutico.

Se están acumulando datos que respaldan el papel de los microARN (miARN) como biomarcadores del asma. Los miARN son pequeños ARN no codificantes que regulan negativamente la expresión génica postranscripcional a través de la desestabilización o degradación del ARNm. [4, 5]. Están involucrados en varios procesos celulares como la proliferación celular, la diferenciación, la migración y la apoptosis. [6] y están desregulados en diversas patologías, incluido el asma [7,8,9,10,11,12]. Además, están implicados en todos los procesos patogénicos clave del asma, incluida la inflamación de las vías respiratorias, la hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) y la hipercontractilidad. Por ejemplo, en un modelo de ratón de asma alérgica, la regulación a la baja de miARN-133a se asoció con una mayor expresión de interleucina 13 y AHR, lo que indica un papel potencial de este miARN en la inflamación y la contractilidad de las vías respiratorias. [13]. Además, la regulación a la baja de miRNA-145 alivió la inflamación eosinofílica, la hipersecreción de moco, la producción de Th2 y la AHR [14] en un modelo de ácaro del polvo doméstico (HDM) de inflamación alérgica. Estudios recientes se han centrado en el uso potencial de los miARN como biomarcadores en diversas enfermedades inflamatorias, incluido el asma. Por ejemplo, en pacientes con asma, se encontró que los miARN circulantes estaban asociados con la función pulmonar (miR-126-3p, miR-1290, miR-146b-5p y miR-206), la gravedad del asma (miR-185-5p), y exacerbaciones (miR-146b-5p, miR-206 y miR-720) [10, 11, 15].

Si bien se ha investigado el uso de miARN circulantes como biomarcadores potenciales para el asma, los resultados contradictorios que asocian los miARN circulantes y el asma han impedido el progreso hacia la búsqueda de biofirmas de diagnóstico y pronóstico confiables. Por ejemplo, Rodrigo-Muñoz et al. identificaron un panel de tres miARN circulantes (miR-185-5p, miR-320a y miR-320b) como biomarcadores para el asma. [11]. Por el contrario, otro grupo mostró un panel distinto de cuatro miARN (miARN-16-5p, miR-223-3p, miR-570-3p y miR-299-5p) expresados ​​diferencialmente en pacientes asmáticos en relación con el grupo y los individuos sanos. con rinitis alérgica [12]. Un estudio posterior encontró un subconjunto de siete miARN que comprende cinco proporciones de miARN como firmas de biomarcadores para el asma [16].

Otro problema de confusión es que los perfiles de expresión de los miARN en respuesta a estímulos fisiológicos o patológicos son específicos de tejido. Por lo tanto, el tejido pulmonar podría ser una fuente más prometedora de descubrimiento de biomarcadores para el asma que los miARN circulantes. En este estudio, comparamos las firmas de miARN de pulmón con los perfiles de miARN circulantes utilizando un modelo preclínico de asma HDM. para abordar la hipótesis de que el pulmón contiene distintos patrones característicos de miARN que pueden servir como biomarcadores únicos para el asma. Hemos identificado un panel de 30 miRNAs como biomarcadores candidatos para el asma. Si bien 18 de los 30 miARN se habían asociado previamente con la patogénesis del asma, hemos encontrado 12 nuevos miARN (miR-3473b, 7061-5p, 217-5p, 369-3p, 411-3p, 381-3p, miR-7224-3p , 491-5p, 3097-5p, miR-6540-5p, 33-3p y 1943-5p) correlacionados con las características del asma.

materiales y métodos

Materiales

Se obtuvo una solución salina al 0,9 % libre de endotoxinas estéril (Nº de catálogo IAX-900-003) de Innaxon, Reino Unido. Ácaro del polvo doméstico (HDM, Dermatophogoides pteronyssinus, nº de cat. XPB70D3A2.5) se adquirieron extractos de Stallergenes (Greer Laboratories, Lenoir, NC). La metacolina (cloruro de acetil-β-metilcolina) era de Sigma Life Sciences (St. Louis, MO). Los kits de preparación de bibliotecas de ADNc y extracción de ARN procedían de QIAGEN (Germantown, MD).

Métodos

Ratones

Se compraron ratones BALB/c machos y hembras, de 6 a 8 semanas de edad, del Laboratorio Jackson y se alojaron en un ambiente libre de patógenos en las instalaciones de medicina animal de laboratorio ubicadas en el Centro de Medicina Molecular de la Universidad de Nevada, Reno ( UNR), Facultad de Medicina. Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).

Protocolo de sensibilización y desafío de HDM

El protocolo HDM se llevó a cabo como se describió anteriormente. [17]. Brevemente, los ratones se sensibilizaron con una administración intranasal de 50 μl de una solución de 25 μg de HDM o solución salina una vez al día durante cinco días consecutivos. A esto le siguió una exposición diaria a HDM o solución salina durante cinco días consecutivos a la semana durante 3 semanas.

Traqueotomía y evaluación de la función pulmonar

Los ratones se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal (ip) de un cóctel de ketamina (90 mg/kg)/xilazina (10 mg/kg). La profundidad de la anestesia se controló con un pellizco en el dedo del pie y una evaluación de la frecuencia cardíaca. Los ratones se colocaron en decúbito supino y se eliminó el vello de la zona del pecho y el cuello utilizando un producto de depilación comercial seguido de hisopos de algodón húmedos para reducir la irritación. Se extrajo la piel, los músculos y la grasa del cuello con tijeras quirúrgicas de acero inoxidable para exponer la tráquea. Se hizo una pequeña incisión lateral en la tráquea superior y se insertó un tubo quirúrgico 1/3 de profundidad en la tráquea por encima de los bronquios primarios. El tubo quirúrgico se aseguró en la tráquea utilizando una sutura estéril. A menudo se administraba ketamina adicional después de la traqueotomía para asegurar una sedación adecuada antes de la evaluación de la función pulmonar. Los ratones fueron ventilados mecánicamente y la resistencia de las vías respiratorias pulmonares y el cumplimiento se midieron en…

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