Análisis del mecanismo molecular común entre la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la osteoporosis

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una afección respiratoria crónica común que ocurre principalmente en personas de mediana edad y ancianos. La EPOC se manifiesta como una limitación progresiva del flujo de aire asociada con una respuesta inflamatoria pulmonar anormal.¹ Como enfermedad con alta incidencia, tasa de discapacidad, curso largo de la enfermedad y múltiples comorbilidades, la EPOC ha afectado gravemente la calidad de vida de los pacientes, imponiendo una grave carga económica a las familias y la sociedad.² Las últimas encuestas epidemiológicas mostraron que la incidencia de EPOC en personas mayores de 40 años en China llegaba al 13,7%.³

La osteoporosis (OP) es una condición comórbida común de la EPOC, que se caracteriza principalmente por pérdida ósea, aumento de la fragilidad ósea y riesgo de fractura.^4,5 La causa de la OP es principalmente un desequilibrio anómalo de la homeostasis ósea entre los osteoblastos y los osteoclastos.^6,7 Los pacientes con EPOC y OP suelen experimentar exacerbaciones más frecuentes, peor calidad de vida y mayor carga económica.⁴ La incidencia de osteoporosis en pacientes con EPOC es mayor. Según un metaanálisis, la frecuencia de osteoporosis en pacientes con EPOC es del 39,91%, falta un método bien aceptado para evaluar la gravedad de la osteoporosis en pacientes con EPOC.⁸ Algunos estudios encuentran que la homeostasis ósea anormal está estrechamente asociada con la expresión anormal de factores inflamatorios.^9,10 Respuesta inflamatoria sistémica y uso de glucocorticoides de pacientes con EPOC, lo que lleva a la aparición o agravamiento de la osteoporosis en pacientes con EPOC, los pacientes con osteoporosis suelen tener disfunción de factores inflamatorios relacionados con trastornos metabólicos e inmunológicos, esto puede exacerbar el curso de la EPOC.¹¹ Los estudios sobre el tratamiento son muy escasos, solo dos artículos mencionan brevemente los resultados terapéuticos de la osteoporosis en pacientes con EPOC y encuentran que solo el 8,1% de los pacientes con EPOC habían recibido terapia farmacológica ósea. La terapia farmacológica ósea en pacientes con EPOC redujo significativamente el riesgo de osteoporosis.^12,13

Múltiples estudios han revelado que los pacientes con EPOC tienen más probabilidades de desarrollar OP; sin embargo, pocos estudios han investigado los mecanismos moleculares comunes de la EPOC y la OP, el mecanismo específico aún no está claro. El microARN (miARN) es una clase de moléculas de ARN no codificante de 18 a 22 nucleótidos de longitud. Los microARN regulan negativamente la expresión génica al unirse a secuencias complementarias en las regiones codificantes 3′ no traducidas de su ARN mensajero (ARNm) diana para mediar en la degradación del ARNm o inhibir la traducción después de la transcripción génica.^14,15 Actualmente, también se ha encontrado que cientos de ARNm diferentes están relacionados con la aparición, el desarrollo y el pronóstico de la EPOC.^dieciséis

Los microARN desempeñan funciones críticas en la regulación de múltiples procesos biológicos; sin embargo, la evidencia sobre la interrelación de la EPOC y la OP es escasa. Descargamos datos de Gene Chip para miARN de sangre periférica de EPOC y osteoporosis de la base de datos GEO. Se realizó un análisis bioinformático para encontrar miRNAs coexpresados ​​en EPOC y OP y explorar el posible mecanismo molecular. Por lo tanto, nuestro estudio descubre aún más la relación entre la EPOC y la OP y proporciona una nueva idea para investigar posibles biomarcadores de la EPOC combinada con la OP.

Materiales y métodos

Diseño del estudio

El diagrama de flujo del estudio se presenta en Figura 1. Los conjuntos de datos de EPOC y OP se descargaron de la base de datos GEO. Primero, identificamos microARN comunes expresados ​​​​diferencialmente (DEmiARN). En segundo lugar, utilizamos las bases de datos targetscan, miRDB y miRWalk para predecir los genes diana aguas abajo de DEmiRNA. Los análisis de enriquecimiento de rutas de ontología génica (GO) y de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) se realizaron utilizando el paquete R clusterProfiler. La base de datos STRING se utilizó para analizar la red de interacción proteína-proteína (PPI), y los módulos centrales y los genes centrales centrales se identificaron utilizando Cytoscape. Recopilamos un resumen tabular del material para obtener detalles metodológicos (Tabla S1).

Figura 1 Diagrama de flujo del diseño del estudio.

Adquisición de datos de microarrays

Seleccionamos datos de micromatrices de miARN de sangre periférica de pacientes con EPOC y OP de la base de datos GEO utilizando las palabras clave “enfermedad pulmonar obstructiva crónica” u “Osteoporosis” y “miARN”. Los criterios de inclusión/exclusión fueron los siguientes: 1) Los perfiles de expresión génica incluían grupos de control y grupos de casos. 2) Todas las muestras de pacientes debían ser muestras de sangre periférica. 3) Se excluyeron pacientes con EPOC u OP con cáncer de pulmón y otras enfermedades. 4) Todos los datos originales están disponibles para un nuevo análisis. 5) Los sujetos no podían usar tratamiento farmacológico u otras intervenciones.

Características del sujeto

Se recuperaron dos conjuntos de datos (GSE102915 y GSE93883) de GEO. Conjunto de datos GSE102915, basado en la plataforma GPL20712 (Agilent-070156 Human miRNA). Obtuvimos un conjunto de datos de EPOC (GSE102915). De estos, seis eran pacientes con EPOC y seis eran controles sanos. Los pacientes con EPOC eran predominantemente hombres. El diagnóstico de EPOC estuvo de acuerdo con los criterios GOLD (FEV₁/CVF < 70%). El conjunto de datos GSE93883 se basó en la plataforma de GPL18058 (exiqon miRCURYLNA microRNA array, séptima generación) y contenía perfiles de expresión de miRNA de sangre periférica de 12 pacientes con OP y 6 sujetos de control sanos. Los pacientes con OP eran predominantemente mujeres de edad avanzada. No se encontraron diferencias estadísticas entre los pacientes con OP y los grupos de control para el índice de masa corporal (IMC), y la densidad mineral ósea (DMO) aparentemente disminuyó en los pacientes con OP. Esto está de acuerdo con las características clínicas de la OP. Las características demográficas de la muestra se presentan en tabla 1.

tabla 1 Características demográficas y de referencia de las muestras en la matriz de microARN

Análisis de expresión diferencial de miARN

Usando la herramienta de análisis en línea GEO2R, ​​realizamos un análisis de expresión diferencial de miARN. P < 0,05 y valor absoluto de log₂ cambio de pliegue (registro₂FC)> 1 se utilizaron como condiciones de detección para determinar la expresión diferencial de miARN en EPOC y OP (DEmiARN). Las visualizaciones de mapas de calor y gráficos de volcanes se realizaron utilizando el paquete R “pheatmap” y “ggplot2”, respectivamente. Usando la herramienta en línea jvenn,¹⁷ tomamos la intersección de DEmiRNAs para obtener DEmiRNAs coexpresados.

Predicción de genes diana de DEmiRNA coexpresados

Usamos TargetScan 8.0,¹⁸ miRDB¹⁹ y miRWalk 3.0²⁰ Para predecir los genes diana de los DEmiRNA coexpresados ​​en la EPOC y la OP, los genes diana que coexistían en las tres bases de datos anteriores se seleccionaron mediante el paquete R UpSetR (versión 1.4.0).²¹

Análisis de enriquecimiento bioinformático de los genes diana

Los análisis GO y KEGG se realizaron utilizando el paquete R ClusterProfiler (versión 4.0.5). PAG < 0.05 se usa como condición de detección, identificamos resultados con significación estadística y usamos R-package ggplot 2 para visualizar los resultados.

El análisis de la red de interacción proteína-proteína de los genes diana

STRING es una base de datos para predecir redes de interacción proteína-proteína (PPI), que pueden predecir interacciones de proteínas aguas abajo.²² Para los genes diana de los miARN diferenciales seleccionados, la interacción de proteínas se predijo mediante STRING y los genes centrales de la proteína en la red reguladora se identificaron con Cytohubba (versión 1.4). La red PPI fue construida por el software Cytoscape (versión 3.7.1). Adicionalmente, las redes fueron analizadas por el plugin MCODE para obtener cluster.

Resultados

Análisis de expresión diferencial de miARN

|log2FC| > 1 y PAG< 0,05 se utilizó como criterio de detección, examinamos los DEmiRNA utilizando las herramientas en línea GEO2R. Se obtuvo un total de 35 DEmiRNAs de datos de microarrays GSE102915 de pacientes con EPOC, un total de 214 DEmiRNAs se obtuvieron de datos de microarrays GSE93883 de pacientes con OP. Los resultados de visualización de los análisis de expresión diferencial se mostraron en el mapa Volcano (Figura 2A y B) y mapa de calor (Figura 2C y D).

Figura 2 Mapas de calor y gráficos de volcanes de miARN expresados ​​diferencialmente (|log2 cambio de pliegue |> 1, valor p ajustado <0.05). (A) Gráfica de volcán del conjunto de datos GSE102915. (B) Gráfica de volcán del conjunto de datos GSE93883. (C) Mapa de calor del conjunto de datos GSE102915. (D) Mapa de calor del conjunto de datos GSE93883. El rojo representa una expresión regulada al alza, el azul significa regulada a la baja y el gris indica que no hay cambios significativos en el gráfico del volcán. El naranja y el azul en los mapas de calor representan pacientes y muestras de control de salud, respectivamente.

Resultados de detección de DEmiRNA coexpresados ​​en EPOC y OP

Tomamos la intersección de los dos conjuntos de datos anteriores y los resultados se presentan en un diagrama de Venn (figura 3). Un total de tres DEmiRNA coexpresados ​​en EPOC y OP, que son hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-194-3p y hsa-miR-30c-1-3p. La tendencia de expresión de hsa-miR-23a-5p y hsa-miR-194-3p fue consistente en EPOC y OP. Mientras que la tendencia de expresión en EPOC de hsa-miR-194-3p fue diferente de la de OP. Por lo tanto, hsa-miR-194-3p se eliminó de los análisis posteriores. La tendencia de cambio de la secuencia de miARN y DEmiARN coexpresados ​​se describe en Tabla 2.

Tabla 2 Información básica de los miARN expresados ​​diferencialmente

figura 3 Diagrama de Venn de diferencias en la expresión de miARN de GSE102915 y GSE93883.

Predicción de genes diana de DEmiRNA coexpresados ​​en EPOC y OP

Usamos targetScan, miRDB y miRWalk para buscar objetivos genéticos de hsa-miR-23a-5p, y…