Análisis del metagenoma microbiano del esputo en la EPOC basado en la frecuencia de exacerbaciones y la función pulmonar: un estudio de casos y controles

Fondo

El papel del microbioma del esputo en la progresión de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) sigue siendo difícil de alcanzar. A medida que el advenimiento de la nueva técnica de secuenciación microbiana independiente del cultivo hace posible revelar la comunidad compleja de microbiomas del tracto respiratorio. El objetivo de este estudio fue utilizar la secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS) para confirmar si existen diferencias en el microbioma del esputo de la EPOC entre diferentes frecuencias de exacerbación y función pulmonar.

Métodos

Treinta y nueve pacientes con EPOC se dividieron en un grupo de exacerbadores frecuentes (FE) (n = 20) y un grupo de exacerbadores no frecuentes (NFE) (n = 19) según su historial de exacerbaciones, o un grupo leve (FEV₁/pre ≥ 50%, n = 20) y un grupo grave (FEV₁/pre < 50%, n = 19) según la función pulmonar. El esputo se recogió durante su fase estable, seguido de la extracción de ADN, la secuenciación de próxima generación metagenómica no dirigida (mNGS) y el análisis bioinformático.

Resultados

mNGS identificó 3355 bacterias, 71 virus y 22 hongos a nivel de especie. Se encontró que el índice de Shannon y el índice de Simpson en el grupo FE fueron más bajos que en el grupo NFE (p = 0,005, 0,008, respectivamente), pero similares entre los grupos leve y grave. De los 10 principales taxones de bacterias, Veillonella, Fusobacterium y Prevotella jejuni tuvieron una mayor abundancia en el grupo NFE, Rothia tuvo una mayor abundancia en el grupo leve. El análisis discriminante lineal reveló que muchos taxones bacterianos eran más abundantes en el grupo NFE, y en su mayoría pertenecían a Actinobacteria, Bacteroidetes y Fusobacteria phyla. También se encontró que la frecuencia de las exacerbaciones se correlacionó negativamente con la diversidad alfa (con el índice de Shannon, r = − 0,423, p = 0,009; con el índice de Simpson, r = − 0,482, p = 0,002). No se observó una correlación significativa entre la diversidad alfa y el FEV₁/pre.

Conclusiones

La diversidad de microbiomas en el grupo FE fue menor que en el grupo NFE. Hubo una diferencia significativa en la abundancia de taxones de microbiomas entre los grupos FE y NFE, o entre los grupos leve y grave. Estos hallazgos demostraron que la disbiosis de la comunidad del microbioma del esputo se asoció con diferentes frecuencias de exacerbación y función pulmonar en la EPOC estable.

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad crónica común caracterizada por síntomas respiratorios persistentes y limitación del flujo de aire. La EPOC es la tercera causa de muerte en el mundo, responsable de aproximadamente el 6% del total de muertes [1]. El impacto de la EPOC sobre la mortalidad y la morbilidad persistirá debido al envejecimiento de la población y la urbanización. La creciente evidencia ha demostrado que la disbiosis de la microbiota pulmonar participa en el progreso de la EPOC [2]. La frecuencia de las exacerbaciones y la función pulmonar son dos índices importantes de la EPOC. El primero está relacionado con la limitación del flujo aéreo, los síntomas y el deterioro de la calidad de vida relacionada con la salud. [3, 4], y el último es un índice que revela la gravedad de la limitación del flujo de aire. Hasta ahora, la diferencia en el microbioma del esputo de la EPOC entre diferentes frecuencias de exacerbación o función pulmonar aún no se conoce bien.

El objetivo principal del presente estudio fue utilizar la secuenciación metagenómica de próxima generación (mNGS), también conocida como secuenciación metagenómica de escopeta, para confirmar si existen diferencias en el microbioma del esputo de la EPOC entre las diferentes frecuencias de exacerbación y la función pulmonar.

Selección y agrupación de pacientes

Los pacientes que solían buscar tratamiento hospitalario por exacerbación de la EPOC en el Departamento de Medicina Respiratoria del Shanghai Tenth People’s Hospital (Shanghai, China) fueron entrevistados por teléfono, y aquellos que cumplieron con los criterios de inclusión y aceptaron participar en la investigación fueron invitados a la dicho hospital para nuevos controles médicos de abril a mayo de 2021. Los criterios de inclusión de los pacientes con EPOC estables fueron: a) síntomas de disnea, tos crónica o expectoración y/o antecedentes de exposición a factores de riesgo de la enfermedad; (b) la presencia de un FEV post-broncodilatador₁/CVF < 0,7; y (c) ningún deterioro sintomático en los últimos 30 días [5]. Se excluyeron los pacientes con neoplasias malignas, insuficiencia cardíaca, trastornos cognitivos y disfunción renal o hepática grave. Se obtuvo información demográfica básica, antecedentes de tabaquismo, frecuencia de exacerbaciones en el último año, escala de disnea modificada del Medical Research Council (mMRC) y el COPD Assessment Test (CAT). Además, los pacientes participantes debían recibir espirometría. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes participantes antes del inicio de la investigación. El protocolo de estudio fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional de dicho hospital.

Los pacientes con al menos 2 exacerbaciones tratadas en el último año se dividieron en un grupo FE, y los pacientes con 1 o menos exacerbaciones tratadas en el último año se dividieron en un grupo NFE. Además, los pacientes también fueron reclasificados en un grupo leve (FEV₁/pre ≥ 50%) y un grupo severo (FEV₁/pre < 50%) según la función pulmonar.

Muestreo

Las muestras fueron el primer esputo expectorado obtenido en la mañana. Los pacientes debían limpiarse la boca antes de expectorar el esputo espontáneamente en un tubo sin ADN.

Extracción de ácidos nucleicos, preparación de bibliotecas y secuenciación

El ADN se extrajo de todas las muestras utilizando un kit QIAamp® UCP Pathogen DNA (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN humano se eliminó usando Benzonase (Qiagen) y Tween20 (Sigma) [6]. Se usaron muestras de ADN de 10 nanogramos para la construcción de bibliotecas a través del kit de preparación de bibliotecas de ADN Nextera XT (Illumina, San Diego, CA) [7]. La biblioteca se evaluó cualitativamente con el kit de ensayo Qubit dsDNA HS, seguido del kit de ADN de alta sensibilidad (Agilent) en un bioanalizador Agilent 2100. Luego, los grupos de bibliotecas se cargaron en un secuenciador Illumina Nextseq 550Dx durante 75 ciclos de secuenciación de extremo único para generar aproximadamente 20 millones de lecturas para cada biblioteca. Para los controles negativos, también preparamos muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) con 10⁵ células/mL de donantes sanos en paralelo con cada lote, utilizando el mismo protocolo, y se extrajo agua desionizada estéril junto con las muestras para servir como controles sin plantilla (NTC) [7, 8]. El agua libre de ADN pasó por la extracción de ADN y el análisis de mNGS como grupo de control en blanco para evaluar el grado de contaminación de fondo asociado con el kit de extracción de ADN y los reactivos de secuenciación juntos.

Análisis bioinformático

Trimmomatic [9] se utilizó para eliminar lecturas de baja calidad, contaminación del adaptador y lecturas duplicadas, así como aquellas de menos de 50 pb. Kcomplexity eliminó las lecturas de baja complejidad con parámetros predeterminados [10]. Los datos de la secuencia humana se identificaron y excluyeron mediante el mapeo de un genoma de referencia humano (hg38) utilizando el software Burrows-Wheeler Aligner. [11].

Después de la alineación, se evaluaron exhaustivamente múltiples indicadores para tener la lista de microorganismos sospechosos. Luego, los perfiles de composición de la microbiota se infirieron a partir de lecturas directas filtradas de calidad utilizando Kraken V.2.1.2 y Bracken V.2.6.2 con la base de datos k2_pluspf_20210517. Los recuentos de sitios por especie y las tablas de abundancia relativa se ingresaron en R-base V.4.1.0 para el análisis estadístico. La diversidad alfa del perfil de microbiota para cada sujeto se evaluó por grupo en los diferentes niveles de datos utilizando el paquete Vegan en R (versión 2.5.7). Se utilizaron ordenaciones de análisis de componentes principales (PCA) para visualizar la agrupación de las muestras en función de los perfiles de composición a nivel de género o especie. Los diferentes grupos se evaluaron mediante análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) y PCA stat con el paquete Vegan en R (versión 2.5.7). El resultado de PCOA fue declarado por la función de dudi.pco en el paquete ade4 en R (versión 1.7.18). Las asociaciones de especies o géneros microbianos específicos con los parámetros del paciente se identificaron utilizando el tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) [12].