Autoanticuerpos neutralizantes contra GM-CSF en proteinosis alveolar pulmonar, meningitis criptocócica y nocardiosis grave

Fondo

Los autoanticuerpos anti GM-CSF (aAb) se han relacionado con la proteinosis alveolar pulmonar adquirida (PAP) y se han descrito en casos de infecciones graves como criptococosis y nocardiosis en sujetos previamente sanos. No está claro si existen diferentes autoanticuerpos anti-GM-CSF correspondientes a estos fenotipos. Por lo tanto, examinamos los autoanticuerpos anti-GM-CSF para determinar si la cantidad o la actividad neutralizante podían distinguir entre grupos.

Métodos

Las muestras de plasma recolectadas en el Instituto Nacional de Salud de pacientes con aAb anti GM-CSF y PAP (n = 15), meningitis criptocócica (n = 15), nocardiosis grave (n = 5) o fenotipos superpuestos (n = 6) fueron comparado. La cantidad relativa de aAb se evaluó utilizando un enfoque basado en partículas, se informó como un GM-CSF antihumano monoclonal de ratón como curva estándar y se expresó en una Unidad de Anticuerpo Monoclonal de Ratón (MMAU) arbitraria. La actividad neutralizante del plasma se evaluó mediante la inhibición de fosfo-STAT5 intracelular inducido por GM-CSF (pSTAT5) en monocitos.

Resultados

Las cantidades relativas de aAb anti-GM-CSF fueron mayores en pacientes con PAP en comparación con aquellos con criptococosis (media 495 ± 464 MMAU contra 197 ± 159 UMM, pags = 0,02); no hubo diferencia con los pacientes con nocardiosis (430 ± 493 MMAU) ni entre los dos tipos de infecciones.

La dilución del plasma que da como resultado una inhibición del 50 % de pSTAT5 inducida por GM-CSF (IC aproximado₅₀) no varió apreciablemente entre los grupos de pacientes (1,6 ± 3,1 %, 3,9 ± 6 % y 1,8 ± 2,2 % en pacientes con PAP, criptococosis y nocardiosis, respectivamente). Tampoco fue necesaria la concentración de GM-CSF para inducir el 50 % de pSTAT5 máximo inducido por GM-CSF en presencia de 10 MMAU de aAb anti-GM-CSF (EC₅₀). Al estudiar muestras longitudinales de pacientes con PAP o nocardiosis diseminada, el efecto neutralizador del aAb anti-GM-CSF fue relativamente constante a lo largo del tiempo a pesar de los tratamientos dirigidos y las variaciones en los niveles de aAb.

Conclusiones

A pesar de las diferentes manifestaciones clínicas, los anticuerpos anti-GM-CSF fueron similares en PAP, criptococosis y nocardiosis. La genética subyacente del huésped y los análisis funcionales pueden ayudar a diferenciar aún más la biología de estas condiciones.

Los autoanticuerpos anti-citocinas son entidades emergentes que pueden explicar algunas infecciones graves en adultos previamente sanos [1]. El ejemplo más reciente son los autoanticuerpos contra el interferón tipo I en pacientes con COVID-19 potencialmente mortal [2]. También se ha demostrado que los autoanticuerpos anti-IFNy neutralizantes son responsables de enfermedades micobacterianas diseminadas. [3, 4]autoanticuerpos anti-interleucina (IL)-6 para infecciones cutáneas estafilocócicas y autoanticuerpos anti-IL-17A/F para candidiasis mucocutánea, [5] aunque esta última asociación ha sido cuestionada recientemente [6]. Estos casos pueden considerarse fenocopias autoinmunes de errores congénitos monogénicos previamente reconocidos, cuyos fenotipos se derivan de alteraciones mendelianas en las mismas vías con los mismos patógenos. [7].

Sin embargo, el caso de los autoanticuerpos antifactor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (anti-GM-CSF) parece ser más complejo. Los anticuerpos anti-GM-CSF se describieron por primera vez en 1999 y ahora se reconocen como la principal causa de proteinosis alveolar pulmonar adquirida. [8]. En los macrófagos pulmonares, la interacción receptor-ligando de GM-CSF induce la transducción de señales, en particular a través de la fosforilación del transductor de señales y activador de la transcripción (STAT)-5 y la inducción del factor de transcripción PU.1, un factor esencial para el catabolismo del surfactante y la inmunidad pulmonar local. [9]. La interrupción de la señalización de GM-CSF conduce a la disfunción de los macrófagos alveolares, la acumulación intraalveolar de material lipoproteináceo y la aparición insidiosa de la enfermedad pulmonar intersticial. [10].

Los autoanticuerpos neutralizantes anti-GM-CSF también se han descrito como factores de riesgo para infecciones diseminadas como la meningitis criptocócica y la nocardiosis diseminada en sujetos previamente sanos. [11, 12]. En todos los casos descritos hasta ahora, el estudio inmunológico completo no ha identificado ningún trastorno inmunológico preexistente, excepto los autoanticuerpos anti-GM-CSF, que vinculan estos anticuerpos con inmunodeficiencias relativamente estrechas. Todas estas infecciones han tenido en común afectación neurológica. Cabe señalar que en la criptococosis asociada a anti-GM-CSF, C. gattiiestá muy sobrerrepresentado en comparación con su pariente más común, C. neoformans [13], lo que sugiere una especificidad estrecha para GM-CSF en la inmunidad neurológica frente a algunos patógenos. Los mecanismos subyacentes a estas especificidades aún no se han dilucidado.

En la mayoría de los casos de infección mediada por autoanticuerpos anti-GM-CSF, la función pulmonar es normal en el momento del diagnóstico de la infección, excluyendo una PAP concomitante significativa en ese momento. En algunos casos, sin embargo, la PAP se ha producido años después de la primera manifestación infecciosa. [12]. Además, cuando los autoanticuerpos anti-GM-CSF se reconocen inicialmente en el contexto de la PAP autoinmune, las infecciones que lo acompañan se limitan principalmente al sistema respiratorio. [14]. Por lo tanto, los fenotipos inducidos por autoanticuerpos anti-GM-CSF son variables y no necesariamente se superponen. Esta observación nos llevó a examinar por qué nominalmente el mismo autoanticuerpo anti-GM-CSF puede causar fenotipos distintos en diferentes huéspedes. En un primer paso para abordar esta cuestión, nos centramos en las características funcionales de los anticuerpos. Recolectamos muestras de plasma de pacientes con PAP autoinmune, meningitis criptocócica y nocardiosis diseminada y comparamos las cantidades relativas de autoanticuerpos anti-GM-CSF y el efecto neutralizador en la señalización de GM-CSF (evaluada por la fosforilación de STAT5) en los monocitos circulantes.

Pacientes

Se recolectaron muestras de sangre de 41 pacientes con autoanticuerpos anti-GM-CSF comprobados entre marzo de 2010 y abril de 2019 en el Laboratorio de Inmunología Clínica y Microbiología de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Veintitrés de estos pacientes fueron vistos en el NIH; las muestras de sangre de los demás habían sido remitidas para su análisis desde sitios colaboradores en los EE. UU. o en el extranjero. Se obtuvieron PBMC normales a través del banco de sangre NIH. Todos los participantes o sus tutores dieron su consentimiento informado por escrito según los protocolos apropiados aprobados por el IRB (07-I-0033, 93-I-0119, 93-I-0106, 95-I-0066).

Determinación y cuantificación de autoanticuerpos anti-GM-CSF.

Las muestras de plasma se analizaron en busca de autoanticuerpos anti-GM-CSF utilizando un enfoque basado en partículas como se describió anteriormente. [15]. Brevemente, se acoplaron covalentemente perlas magnéticas fluorescentes (Bio-Rad; MC1-0029-01) a 2,5 μg de GM-CSF humano recombinante (R&D Systems; catálogo 215-GM-050/CF). Las perlas se incubaron con muestras de plasma durante 30 minutos, se lavaron y luego se incubaron con IgG antihumana de cabra marcada con PE (ThermoScientific) durante 30 minutos adicionales antes de ejecutarlas en el instrumento Bio-Plex X200 (Bio-Rad). Se obtuvo una curva estándar ejecutando en cada placa un anticuerpo monoclonal de ratón anti-GM-CSF humano (R&D Systems) con diluciones seriadas que oscilaban entre 50 y 0,7125 ng/ml (R² de pendientes de interpolación > 0,98), revelada secundariamente por una IgG anti-ratón de cabra marcada con PE (ThermoScientific). La cantidad relativa de anticuerpos en muestras de pacientes se determinó mediante la intensidad de fluorescencia media (MFI) de las muestras en comparación con las de la curva estándar. Debido al uso de un anticuerpo monoclonal de ratón como estándar en lugar de anticuerpos policlonales humanos purificados, decidimos expresar los resultados de concentración en una Unidad de Anticuerpo Monoclonal de Ratón (MMAU) arbitraria. Cada muestra de paciente se analizó en tres ocasiones distintas con al menos tres diluciones diferentes entre 1/5000 y 1/500000 y se promediaron los resultados de la dilución más reproducible que se ajustaba a la mayoría de los puntos de la curva estándar.

Aislamiento de plasma, cultivo celular y estimulación.

El plasma de cada sujeto se separó de la sangre entera y…