Cambios funcionales en cortes de pulmón cortados con precisión de ratas incubadas a largo plazo

by | Oct 27, 2022 | 0 comments

Resumen

Fondo

Las enfermedades respiratorias representan una carga para la salud mundial. Debido a que la investigación sobre las estrategias terapéuticas de las enfermedades de las vías respiratorias es esencial, la técnica de cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS) se ha desarrollado y estudiado ampliamente. Los PCLS son un modelo ex vivo alternativo y tienen el potencial de reemplazar y reducir los modelos animales in vivo. Hasta ahora, la mayoría de los estudios se realizaron con PCLS cultivadas a corto plazo (≤ 72 h). Dado que existe un gran interés en la investigación de enfermedades crónicas y toxicidad crónica, otro grupo de investigación investigó la viabilidad de cultivar PCLS humano a largo plazo durante 2 semanas y recientemente durante 4 semanas con resultados exitosos. Nuestro objetivo era establecer un modelo de PCLS de rata cultivada a largo plazo durante un período de 29 días.

Métodos

Se cultivaron PCLS de rata durante 29 días y se analizaron en cuanto a viabilidad, histopatología, reactividad y expresión génica en diferentes momentos durante el cultivo.

Resultados

El cultivo de PCLS de rata durante un período de tiempo de 29 días fue exitoso con viabilidad sostenida. Además, la capacidad de broncoconstricción se mantuvo entre 13 y 25 días, dependiendo del mediador. Sin embargo, se observó relajación reducida, sensibilidad alterada y aumento del tono respiratorio. En cuanto a la transcripción, se comprobó la alteración en el patrón de expresión génica de los genes objetivo investigados durante el cultivo a largo plazo con resultados mixtos. Además, la preparación de PCLS parece influir en la expresión del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de la mayoría de los genes diana. Además, la adición de suero bovino fetal (FBS) al medio de cultivo no mejoró la viabilidad de PCLS. En contraste con el medio sin FBS, FBS parece afectar las mediciones y dio como resultado cambios celulares marcados de origen metaplásico y/o regenerativo.

Conclusiones

En general, se podría establecer un modelo de PCLS de rata cultivada a largo plazo que permanece viable durante 29 días y reactivo durante al menos 13 días. Antes de que el PCLS cultivado a largo plazo pueda usarse para un estudio en profundidad de enfermedades crónicas y toxicidad crónica, se deben realizar más investigaciones.

Fondo

Las enfermedades respiratorias como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o las infecciones respiratorias agudas se encuentran entre las principales causas de muerte en todo el mundo [1] y representan una carga para la salud mundial. Según estimaciones de 2019, 262 millones de personas padecían asma, mientras que la prevalencia de la EPOC ascendía a 212 millones en todo el mundo [2]. Ambas enfermedades respiratorias crónicas ocasionan altos costos económicos y sociales por incapacidad y mortalidad prematura. Esto incluye costos directos relacionados con medicamentos y servicios de salud, así como costos indirectos relacionados con la pérdida de producción. [3]. Todos estos hechos hacen imprescindible una mayor investigación sobre las estrategias terapéuticas de estas enfermedades respiratorias crónicas.

En los últimos años, ha habido un gran interés en los modelos de tejidos organotípicos. Por lo tanto, la técnica de cortes de pulmón cortados con precisión (PCLS) se investigó a fondo en la investigación respiratoria. Los PCLS son cortes viables de tejido pulmonar en 3D de aproximadamente 250 µm de grosor con microanatomía intacta y composición celular preservada [4, 5]. Además de las investigaciones sobre la funcionalidad de las vías respiratorias [4, 6,7,8]mediciones de los efectos vasculares [9,10,11] y función mucociliar [12, 13]PCLS se utilizan para estudios farmacológicos y toxicológicos [14,15,16]. Además, PCLS se puede utilizar para evaluar los efectos de la sensibilización. [13, 17]asma [18]EPOC [19]fibrosis [19] y enfermedades infecciosas [20, 21]. Especialmente los PCLS humanos de pacientes relativamente sanos y enfermos representan una herramienta valiosa para determinar diferencias en estudios funcionales y posibles tratamientos farmacológicos. [22].

La mayoría de los estudios se realizaron con PCLS cultivado durante un corto período de tiempo (≤ 72 h) [7, 13, 23] y por lo tanto se limitaba a cuestiones relacionadas con los efectos agudos de las drogas y los productos químicos. Además de estos experimentos a corto plazo, existe un gran interés en la investigación de los efectos crónicos de los fármacos, así como en las investigaciones de los mecanismos y métodos de tratamiento de las enfermedades crónicas de las vías respiratorias (p. ej., asma, EPOC). Por esta razón, otro grupo de investigación probó la viabilidad del PCLS humano cultivado a largo plazo como modelo crónico durante un período de 2 semanas. [24, 25]. Informaron sobre la viabilidad sostenida, la reactividad y la integridad estructural de PCLS durante el período de tiempo investigado. Recientemente, se pudo demostrar la viabilidad del PCLS humano hasta por 4 semanas; sin embargo, se observó una pérdida celular continua, una disminución del latido ciliar y una manifestación creciente de metaplasia escamosa queratinizante con el tiempo. [26].

El objetivo del estudio actual fue establecer un modelo de PCLS de rata cultivada a largo plazo durante un período de 29 días. Con respecto al cultivo a largo plazo surgieron varias preguntas que abordaremos en el manuscrito:

Primero, ¿PCLS se mantiene viable y libre de contaminación durante un período de 29 días y, de ser así, los cortes se mantienen reactivos y mantienen su capacidad de broncoconstricción? En segundo lugar, ¿existen cambios en el patrón de expresión génica y la viabilidad que podrían explicar los posibles efectos sobre la broncoconstricción y la viabilidad puede verse afectada por la adición de suero bovino fetal (FBS)? Finalmente, ¿la preparación de PCLS afecta la expresión génica basal?

materiales y métodos

animales de laboratorio

Se tomaron pulmones de ratas Wistar hembra (305 ± 20 g) obtenidas de Janvier Labs (Le Genest-Saint-Isle, Francia). Los animales se mantuvieron en condiciones controladas (22 °C, 55% de humedad, ritmo de 12 h día/noche) y recibieron alimento de laboratorio y agua del grifo ad libitum.

Medios de cultivo y reactivos

La agarosa de bajo punto de fusión se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Alemania). El medio de cultivo consistió en medio mínimo esencial (pH 7.2) compuesto por CaCl2MgSO4KCl, NaCl, NaH2correos4glucosa, NaHCO3 (todos de Sigma-Aldrich), HEPES (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemania), piruvato de sodio, glutamina (ambos de Capricorn Scientific GmbH, Ebsdorfergrund, Alemania), aminoácidos y vitaminas (ambos de Sigma-Aldrich) y se complementó con penicilina y estreptomicina (Sigma-Aldrich) (Archivo adicional 1: Tabla S1) como se describe anteriormente [27]. El medio de corte constaba de los mismos componentes excepto piruvato de sodio, glutamina, aminoácidos, vitaminas, penicilina y estreptomicina. Además, para las pruebas de viabilidad se utilizó un medio de cultivo con adición de FBS al 10% inactivado por calor y filtrado estéril (Thermo Fisher Scientific, Life Technologies Europe BV, Bleiswijk, Países Bajos, Gibco 10,270).

Preparación de PCLS

Los PCLS se prepararon como se describió antes. [28] con algunas modificaciones. Brevemente, se realizó anestesia intraperitoneal con 60 mg/kg de pentobarbital sódico (Narcoren; Merial GmbH, Hallbergmoos, Alemania) y se verificó por falta de reflejos. Posteriormente, se abrió el abdomen y la rata se desangró. A partir de entonces, siguieron la toracotomía y la traqueotomía. accesorio lobus del pulmón derecho se ligó para evitar que el lóbulo se llenara de agarosa. El pulmón se infló con 15-20 ml de agarosa tibia al 1,5% de bajo punto de fusión a través de la tráquea, según el peso del animal y hasta que se desarrolló una ligera resistencia y luego se solidificó en hielo. Después de la polimerización de la agarosa, se extrajo el pulmón. en bloque, los lóbulos se separaron y se prepararon núcleos de tejido con una vía aérea centrada perpendicular al eje largo con un tubo de metal afilado giratorio (diámetro: 10 mm). Se cortaron rodajas finas de aproximadamente 250–300 µm con un micrótomo (Krumdieck Tissue Slicer, Alabama Research and Development, Munford, AL, EE. UU.). Los cortes se colocaron en placas de Petri con medio de cultivo calentado y se incubaron a 37 °C en una atmósfera húmeda de dióxido de carbono al 5 %. Después de la preparación, el medio se cambió varias veces dentro de las primeras 4 h para eliminar los restos celulares y los mediadores liberados del tejido. Al día siguiente, los cortes se colocaron en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos en 1 ml de medio de cultivo. Las placas se mantuvieron…

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