Caracterización del remodelado vascular pulmonar y MicroRNA-126-targets en EPOC-hipertensión pulmonar

Fondo

A pesar de causar una mayor morbilidad y mortalidad, la hipertensión pulmonar (HP) en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (EPOC-PH) carece de tratamiento, debido a la comprensión incompleta de su patogenia. La hipertrofia de las paredes arteriales pulmonares y la poda de la microvasculatura con pérdida de los lechos capilares son características conocidas de la remodelación vascular pulmonar en la EPOC. Las características de remodelación de los vasos pulmonares medianos y pequeños en los pulmones con EPOC-HP están menos descritas y pueden estar relacionadas con la mala adaptación de las células endoteliales al tabaquismo crónico (CS). MicroRNA-126 (miR126), un regulador maestro del destino de las células endoteliales, tiene funciones divergentes que son específicas del tamaño de los vasos, apoyando la supervivencia de las células endoteliales de los vasos grandes e inhibiendo la proliferación de células endoteliales microvasculares. Dado que CS disminuye miR126 en células endoteliales de pulmón microvascular, nos propusimos caracterizar la remodelación por tamaño vascular pulmonar en EPOC-PH y su relación con miR126 en EPOC y EPOC-PH pulmones.

Métodos

El tejido pulmonar no identificado se obtuvo de individuos con EPOC con y sin HP y de fumadores y no fumadores no enfermos. La remodelación de la arteria pulmonar se evaluó mediante la abundancia de actina de músculo liso (SMA) ⍺ mediante inmunohistoquímica y se analizó por el tamaño de la arteria pulmonar. La abundancia de miR126 y miR126-objetivo se cuantificó mediante qPCR. Los niveles de expresión de ceramida, ADAM9 y el marcador de células endoteliales CD31 se evaluaron mediante inmunofluorescencia.

Resultados

Las arterias pulmonares de los pulmones con EPOC y EPOC-PH habían aumentado significativamente la abundancia de SMA en comparación con los pulmones sin EPOC, especialmente en las arterias pulmonares pequeñas y la microvasculatura pulmonar. Esto estuvo acompañado por una cantidad significativamente menor de marcadores de células endoteliales y una mayor abundancia de ceramida proapoptótica. La expresión de miR126 disminuyó significativamente en los pulmones de personas con EPOC. De los objetivos probados (SPRED1, VEGF, LAT1, ADAM9), pulmón miR126 más significativamente inversamente correlacionado con ADAM9 expresión. En comparación con los controles, ADAM9 aumentó significativamente en los pulmones con EPOC y EPOC-PH, predominantemente en las arterias pulmonares pequeñas y la microvasculatura pulmonar.

Conclusión

Tanto los pulmones con EPOC como con EPOC-PH exhibieron una remodelación significativa del lecho vascular pulmonar de tamaño pequeño y microvascular, lo que sugiere que estos cambios pueden ocurrir antes o independientemente del desarrollo clínico de HP. La disminución de la expresión de miR126 con el aumento recíproco de ADAM9 puede regular la supervivencia de las células endoteliales y la remodelación vascular en las arterias pulmonares pequeñas y la microvasculatura pulmonar en la EPOC y la EPOC-PH.

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una de las 4 principales causas de muerte [1,2,3]. A pesar de estar caracterizada por elevaciones de leves a moderadas en la presión arterial pulmonar media (PAPm), la hipertensión pulmonar (HP) es un determinante importante del aumento de la morbilidad y la mortalidad en la EPOC [4,5,6,7]. De hecho, un aumento de 10 mmHg en la presión arterial pulmonar media en reposo se asocia con una mortalidad cuatro veces mayor [8]. A diferencia de los grandes avances en la hipertensión arterial pulmonar (HAP) idiopática, existe poca comprensión de la patogenia de la HP en la EPOC (EPOC-HP), lo que explica la escasez de opciones terapéuticas para esta afección.

De forma similar a la PAH, las arterias pulmonares en la EPOC-PH muestran hipertrofia tanto de la íntima como de las células del músculo liso vascular compuestas por la túnica media. [9]junto con la poda de las pequeñas arterias pulmonares y la microvasculatura precapilar [10]. Sin embargo, a diferencia de la PAH, los pulmones con EPOC-PH no presentan células endoteliales hiperproliferativas que formen lesiones plexiformes oclusivas vasculares típicas de la PAH. [11]lo que sugiere que los mecanismos de remodelación vascular pulmonar en la EPOC-PH pueden no recapitular completamente los de la HAP.

El tabaquismo (CS), el principal factor etiológico de la EPOC, causa lesión y disfunción de las células endoteliales, que se cree que son procesos importantes en la remodelación vascular pulmonar en la EPOC-HP [7, 12]pero actualmente se carece de un mecanismo unificador que explique cómo los lechos vasculares pulmonares de varios tamaños se ven afectados de manera diferencial.

Recientemente identificamos que el microARN-126 (miR126), un regulador maestro proangiogénico, favorable a la supervivencia y reparador bien establecido de las células endoteliales que recubren la gran vasculatura pulmonar y sistémica [13]inhibe la migración, proliferación y supervivencia de células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HLMVEC) [14]. Estos efectos diferenciales en lechos vasculares específicos son ejercidos por objetivos específicos del tipo de célula, por lo que los efectos proangiogénicos en las células endoteliales de la arteria pulmonar grande están mediados por la inhibición de SPRED1 (que contiene el dominio EVH1 relacionado con brotes 1) o PIK3R2, ambos reguladores negativos de VEGF (factor de crecimiento del endotelio vascular) señalización [15, 16]. Por el contrario, el efecto antiangiogénico de miR126 en HLMVEC está mediado por la inhibición del transportador de aminoácidos SLC7A5/LAT1 (familia de transportadores de solutos 7, miembro 5), que se requiere para la señalización de mTOR. [14]. El efecto diferencial sobre las células endoteliales de distintos tamaños de vasos pulmonares hace que miR126 sea un mediador potencial en la EPOC-PH, pero no se ha descrito cómo se ven afectados miR126 y sus objetivos en la EPOC-PH.

Tanto la exposición a CS como la EPOC tienen un marcado efecto en miR126. La exposición a CS disminuye la expresión intracelular de miR126 en HLMVEC y aumenta la secreción de miR126 en los exosomas endoteliales [17]. Células endoteliales de sangre periférica de fumadores y personas con EPOC, y pulmones de ratones expuestos a CS [18] exhiben una expresión significativamente disminuida de miR126, también. El efecto funcional de miR126 reducido en estas condiciones no está bien dilucidado. Descubrimos que la disminución de miR126 en HLMVEC expuesto a CS puede ser adaptativa, al proteger contra la apoptosis y al promover la formación de tubos, a través del aumento de LAT1 [14]. Además, identificamos objetivos miR126 adicionales en HLMVEC, incluido ADAM9. La metaloproteasa ADAM9 ha sido reconocida recientemente como un mediador importante no solo de la lesión pulmonar aguda, sino también de la EPOC, y está implicada en la inflamación pulmonar, la apoptosis del tabique alveolar, el enfisema, la fibrosis de las vías respiratorias pequeñas y la metaplasia de células mucosas en ratones. [19, 20]. A su vez, en el cáncer de pulmón, ADAM9 aumenta la angiogénesis y mejora la remodelación vascular pulmonar [19]. Juntos, estos hallazgos sugieren que miR126 y su objetivo ADAM9 pueden desempeñar un papel importante en la remodelación vascular en la EPOC, pero aún no se ha informado su abundancia en la EPOC-PH.

Usando tejido pulmonar humano de personas con antecedentes de tabaquismo, EPOC o EPOC-PH, buscamos caracterizar la remodelación arterial pulmonar en estos grupos en relación con la expresión de miR126 y ADAM9.

Tejido pulmonar humano (Archivo adicional 1: Tabla S1)

Se obtuvieron pulmones desidentificados de fumadores crónicos y no fumadores no enfermos del National Jewish Health Human Lung Consortium; los pulmones de la EPOC en etapa 4 de la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (GOLD) se obtuvieron del Consorcio de Investigación de Tejido Pulmonar (LTRC); y los pulmones de EPOC y EPOC-PH se obtuvieron de la Universidad de Texas Houston Lung Biobank.

inmunohistoquímica

Se calentaron a 60 °C secciones de 3 µm de espesor de pulmones incluidos en parafina, seguido de desparafinización en solvente híbrido CitriSolv (Thermo Fisher; 04-355-121; Waltham, MA, EE. UU.) y lavados en serie del 100 %, 95 % y soluciones de etanol al 70%. La recuperación de antígenos se realizó en una olla a presión con solución de desenmascaramiento de antígenos a base de ácido cítrico (Vector; H-3300; Burlingame, CA, EE. UU.; 1:100). Luego, las secciones de tejido se incubaron en peróxido de hidrógeno al 0,3% (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO, EE. UU.; H325-100) durante 1 hora, se bloquearon en suero de caballo (Vector; PK-6200; 1:100), se incubaron anticuerpo primario de actina de músculo liso (SMA) (Dako; M0851; Glostrup, Dinamarca; 1:500) durante la noche a 4 °C, seguido de anticuerpo secundario biotinilado anti-ratón (Vector; BA-2000; 1:250) durante 1 h a temperatura ambiente. El técnico…