CircGSAP alivia la disfunción de las células endoteliales microvasculares pulmonares en la hipertensión pulmonar mediante la regulación del eje miR-27a-3p/BMPR2

Fondo

Nuestro estudio anterior mostró que la proteína activadora de ARN-gamma-secretasa circular (circGSAP) se reguló a la baja en las células endoteliales microvasculares pulmonares (PMEC) en respuesta a la hipoxia, y reguló el ciclo celular de las PMEC a través de la esponja miR-942-5p en pulmonar. hipertensión (HP). Sin embargo, el mecanismo de si circGSAP afecta la disfunción de los PEMC a través de otros microARN (miARN) sigue siendo en gran parte desconocido. Por lo tanto, nuestro objetivo fue demostrar los mecanismos subyacentes de circGSAP que regulan la disfunción de las PMEC mediante la absorción de otros miARN para regular los genes diana en la hipertensión arterial pulmonar idiopática (HAPI).

Métodos

Se utilizaron la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, la tinción de inmunofluorescencia, el kit de recuento de células 8, la tinción de calceína AM/PI, el ensayo Transwell, el ensayo informador de luciferasa dual y ELISA para dilucidar las funciones de circGSAP.

Resultados

Aquí mostramos que los niveles de circGSAP en plasma se redujeron significativamente en pacientes con HAPI y se asociaron con malos resultados. In vivo, la sobreexpresión de circGSAP mejoró la supervivencia y alivió la remodelación vascular pulmonar de ratas con PH inducida por monocrotalina (MCT-PH). In vitro, la sobreexpresión de circGSAP inhibió la proliferación y migración de PMEC inducidas por hipoxia y aumentó la mortalidad al absorber miR-27a-3p. BMPR2 se identificó como un gen objetivo miR-27a-3p. El silenciamiento de BMPR2 mejoró el efecto del inhibidor miR-27a-3p sobre la proliferación, migración y mortalidad de PMEC. Los niveles de BMPR2 aumentaron en PMEC sobreexpresadas con circGSAP y tejidos pulmonares de ratas MCT-PH.

Conclusión

Nuestros hallazgos demostraron que circGSAP alivió la disfunción de las PMEC a través del aumento de BMPR2 mediante la unión competitiva con miR-27a-3p y mitigó la remodelación vascular pulmonar de ratas MCT-PH, proporcionando posibles estrategias terapéuticas para la HAPI.

La hipertensión arterial pulmonar idiopática (HAPI) se caracteriza por la remodelación y obliteración de la vasculatura pulmonar, lo que resulta en un aumento progresivo de la resistencia vascular pulmonar y sobrecarga de presión del corazón derecho. [1]. La disfunción de las células endoteliales (CE) se considera el desencadenante de la remodelación vascular pulmonar. La disfunción de las CE puede conducir a la formación de neoíntima, infiltración inflamatoria, fragmentación de la lámina elástica y vasoconstricción acompañada de muscularización y depósitos de calcio en las arterias pulmonares [2,3,4,5]. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar las moléculas importantes que desencadenan la disfunción de las EC e impulsan la remodelación vascular, y explorar su potencial terapéutico.

Los ARN circulares desregulados (circRNA) desempeñan un papel en la progresión de la patobiología de la hipertensión pulmonar (HP) [6,7,8], particularmente en la remodelación vascular pulmonar. Los estudios in vivo emergentes han proporcionado pruebas convincentes de la contribución de los circRNA a la remodelación vascular pulmonar y la patogénesis de la HP. Como tal, se han identificado varias vías de circRNA-microRNA (miRNA)-RNA mensajero (mRNA) como nuevos mecanismos de remodelación vascular pulmonar. La lesión de la íntima arterial pulmonar es una característica bien definida de la remodelación vascular en la HP. Existe amplia evidencia de disfunción endotelial en la HP, como respuestas angiogénicas alteradas, cambios metabólicos y activación inapropiada de cascadas inflamatorias. [2]. Aunque muchos postulan que el endotelio es el sitio de incitación a la lesión y apoptosis seguida de hiperproliferación y aumento de la migración [9]los mecanismos por los cuales los circRNA afectan las funciones de las células endoteliales microvasculares pulmonares (PMEC) en la HP aún no se comprenden por completo.

Recientemente descubrimos que los niveles bajos de proteína activadora de circRNA-gamma-secretasa (circGSAP) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se asociaron con la aparición de HAPI y malos resultados, lo que indica que circGSAP podría ser un biomarcador para el diagnóstico y pronóstico de HAPI [10]. También observamos que la disminución de circGSAP facilitó la proliferación celular y la resistencia a la apoptosis a través de la unión competitiva de miR-942-5p para modular las expresiones de SMAD4 en PMEC. [11]. Sin embargo, no está claro si circGSAP adsorbe otros miARN para desempeñar un papel en la disfunción de las PEMC y la PH experimental. Por lo tanto, nuestro objetivo fue investigar los mecanismos subyacentes por los cuales circGSAP absorbe otros miARN a través de la regulación de genes objetivo para proteger a las PMEC de la disfunción, lo que podría generar nuevos objetivos terapéuticos para la HAPI.

Muestras clínicas

Se obtuvieron muestras de plasma humano de 41 pacientes incidentes con HAPI y 50 individuos sanos del Hospital Pulmonar de Shanghái, Facultad de Medicina, Universidad de Tongji, desde enero de 2015 hasta octubre de 2022. El diagnóstico de HP se estableció de acuerdo con la Sociedad Europea de Cardiología y Respiratorio Europeo. Pautas de la sociedad [12]. Los pacientes con otras clasificaciones de HP o con diabetes fueron excluidos del estudio. Este estudio fue aprobado y supervisado por el Comité de Ética del Hospital Pulmonar de Shanghai (número: K20-150Y). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Líneas celulares

Todas las líneas PMEC humanas primarias se compraron de ScienceCell (BK-3000, Shanghái, China). Brevemente, las PMEC primarias se cultivaron en medio de células endoteliales (BK-1001, Shanghái, China) complementado con suero bovino fetal al 10 % (BK-1001, Shanghái, China), penicilina/estreptomicina al 1 % (BK-1001, Shanghái, China) , y suplemento de crecimiento de células endoteliales al 1% (BK-1001, Shanghái, China) en un CO₂ (5%) atmósfera a 37 °C. Para el cultivo celular bajo hipoxia, las PMEC se expusieron a CO₂ (5%)/O₂ (3%)/saldo de N₂ durante 24 h.

Transfección de plásmidos, siRNA y células

La secuencia de circGSAP se amplificó y se clonó en el vector de sobreexpresión de circRNA pLC5-ciR (Geneseed, Guangzhou, China). Los cebadores utilizados para la clonación se muestran en el archivo adicional 1: Tabla S1. GenePharma (Shanghai, China) diseñó y sintetizó tres siRNA dirigidos a circGSAP y BMPR2. GenePharma (Shanghai, China) sintetizó el inhibidor de miR-27a-3p, el imitador de miR-27a-3p y el miARN de control negativo (NC). Las secuencias se mostraron en el archivo adicional 1: Tabla S1. Los PMEC se transfectaron con el plásmido de sobreexpresión o siRNA mediante el reactivo de transfección Lipo2000 (Invitrogen, EE. UU.). Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pocillos, se cultivaron durante 24 h y se transfectaron con siRNA de circGSAP, siRNA de BMPR2 y siRNA-NC usando el Lipo2000 a una concentración final de 100 nM. Las PMEC con una confluencia del 70-80 % se transfectaron con 10 µL de siRNA y 10 µL del reactivo de transfección de siRNA Lipofectamine 2000, que se diluyeron por separado en 100 µL de DMEM. Los reactivos se incubaron por separado durante 5 min, luego se mezclaron y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. La mezcla de siRNA-reactivo de transfección se añadió directamente a las células. Las células se colocaron en una cámara anóxica 6 horas más tarde y luego se cultivaron durante otras 24 horas y se usaron en experimentos posteriores.

Construcción del AAV-circGSAP e inyección intratraqueal

La secuencia circGSAP se clonó en el vector pHBAAV-CMV-circ-EF1-ZsGreen, que luego se empaquetó en AAV de Hanheng Company (Hanheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). Las ratas se anestesiaron con isoflurano y se les administró 200 µl de pHBAAV6-CMV-circGSAP-EF1-ZsGreen (AAV-circGSAP) (1,1 × 10¹² vg/ml) mediante inyección intratraqueal. Las ratas de control se trataron con el AAV de control. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con y fueron aprobados por el Instituto de Investigación en Animales de Laboratorio en el Centro de Animales Experimentales de la Universidad de Tongji, Shanghái, China.

estudios con animales

Sesenta y ocho ratas macho Sprague-Dawley (SD) con un peso de 180 a 220 g, de 6 a 8 semanas de edad, se obtuvieron de la Universidad de Tongji y se mantuvieron en un entorno libre de patógenos específicos. Los experimentos se ajustaron a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio del Instituto para la investigación con animales de laboratorio en el Centro de animales experimentales de la Universidad de Tongji, Shanghái, China.

PH inducida por MCT…