ColdZyme® protege el epitelio de las vías respiratorias de la infección por BA.4/5

Las vacunas contra el SARS-CoV-2 protegen de la patogenia crítica o grave y también de las nuevas variantes preocupantes (COV) como BA.4 y BA.5, pero se necesitan intervenciones inmediatas para evitar la transmisión viral y las reacciones inflamatorias posteriores. Aquí aplicamos el spray bucal para dispositivos médicos ColdZyme® a epitelio humano polarizado completamente diferenciado cultivado en una interfase aire-líquido (ALI). Con los COV BA.1 y BA.4/5, descubrimos que este dispositivo bloqueó eficazmente la infección del tejido respiratorio. Si bien la infección con estos COV dio como resultado la activación del complemento intracelular, lo que aumentó la inflamación y la caída de la resistencia transepitelial, estos fenómenos se evitaron con una sola administración de este dispositivo médico. Por lo tanto, el spray bucal ColdZyme® protege significativamente la integridad epitelial, dificulta la infección por virus y bloquea en un efecto secundario la activación intrínseca del complemento dentro de los cultivos de las vías respiratorias, también en términos de los COV altamente contagiosos BA.4/5. Fundamentalmente, nuestros datos in vitro sugieren que el spray bucal ColdZyme® puede tener un impacto para proteger contra la transmisión del SARS-CoV-2, también en el caso de las variantes Omicron BA.1, BA.4 y BA.5.

Surgen rápidamente nuevas variantes preocupantes (COV) del SARS-CoV-2. En enero de 2022, aparecieron en Sudáfrica los dos linajes recientes de Omicron, BA.4 y BA.5 (en adelante, BA.4/5). [1]. BA.4/5 reemplazó rápidamente a BA.1 y BA.2 y provocó una nueva ola de COVID-19 en Europa a principios del verano de 2022, debido a una mejor transmisibilidad y una mayor infectividad en relación con BA.2 [1]. BA.4/5 tienen secuencias idénticas de proteína de pico viral (S). BA.4/5 contiene mutaciones adicionales en el dominio de unión al receptor (RBD), en particular las mutaciones 69-70del, L452R y F486V, mientras que carece de la sustitución R493Q en relación con BA.2 [1, 2]. Las vacunas utilizadas actualmente están diseñadas contra el SARS-CoV-2 de tipo salvaje. Debido a sus múltiples mutaciones, se informó que el sublinaje Omicron del SARS-CoV-2 escapa de los anticuerpos provocados por la vacuna y la infección. [3,4,5,6,7,8], lo que hace que estos COV sean altamente transmisivos y causen altas tasas de incidentes. Así, incluso después de más de dos años, todavía faltan tratamientos actualizados y eficaces para evitar la transferencia del virus de uno a otro.

Como se mostró recientemente, el aerosol bucal ColdZyme® bloqueó de manera efectiva la unión, la absorción y la infección del SARS-CoV-2 de tipo salvaje en un modelo respiratorio humano que se asoció con el rescate de la integridad del tejido y de la activación inmunitaria innata excesiva. [9]. ColdZyme® es un dispositivo médico de Clase III (marcado CE) compuesto por glicerol, agua, tampón, CaCl2, mentol y tripsina del bacalao del Atlántico (Gadus morhua) [10] (ClinicalTrials.gov, identificación: NCT03901846). El spray bucal ColdZyme® forma una barrera física que interfiere con la entrada de los virus del resfriado común, que posteriormente quedan atrapados e inactivados [11, 12]. Debido a estas acciones, ColdZyme® podría obstaculizar la entrada de virus y esto se ilustró in vitro utilizando virus como el rinovirus, RSV o influenza. [11]. ColdZyme inactivó estos virus en un rango entre 60 y 100%, cuando se aplicó durante 20 min a 35 a 37 °C [11]. Además de su alta eficacia, el dispositivo médico también ejerce un alto perfil de seguridad, que puede explicarse por la alta sensibilidad de la tripsina de bacalao, un ingrediente de ColdZyme®, al pH y al calor dentro de la mucosa oral. Además del rinovirus, el RSV y la influenza, se demostró que el SARS-CoV-2 y el coronavirus del resfriado común HCoV-229E son sensibles al tratamiento profiláctico con el aerosol bucal ColdZyme® en análisis in vitro anteriores dentro de varios sistemas celulares, es decir, Vero E6 y MRC. -5 células, pero también en cultivos de tejido epitelial de las vías respiratorias humanas en 3D [9, 13]. Posch et al. mostró recientemente una participación sólida del complemento en cultivos de tejido epitelial de las vías respiratorias humanas (HAE) después de una infección viral, que se asoció con una liberación alta de anafilatoxina y citoquinas proinflamatorias, cargas virales altas y destrucción excesiva de tejido [9, 13]. Estos efectos mediados por virus podrían interferirse de manera eficiente al bloquear el receptor de anafilatoxina C5aR en los sitios basolaterales de los tejidos epiteliales, pero también al aplicar el aerosol bucal ColdZyme® a los modelos de tejido 3D epiteliales bronquiales y nasales primarios altamente diferenciados antes de la infección con SARS-CoV. -2 virus de tipo salvaje [9, 13]. Por lo tanto, aquí probamos la eficacia del aerosol contra las variantes altamente contagiosas BA.1 de Omicron y, lo que es más importante, BA.4/5. Si bien se detectó destrucción de tejido con inmunidad innata concomitante, complemento C3, activación y alta liberación de virus en el subnadante basolateral tras la infección con BA.1 y BA.4/5, la integridad del tejido se restauró por completo y se bloqueó la producción local de complemento C3 y la liberación de virus. por el spray bucal ColdZyme®. Nuestros resultados apuntan hacia un tratamiento profiláctico regular y fácil de usar con el spray bucal ColdZyme® para prevenir infecciones, en particular con las variantes actuales, altamente transmisibles BA.4/5.

Declaración de Ética

Las clínicas participantes obtuvieron el consentimiento informado por escrito de todos los donantes de muestras sobrantes de nasofaringe/orofaringe y sangre con EDTA. El Comité de Ética de la Universidad Médica de Innsbruck (ECS1166/2020) aprobó el uso de muestras sobrantes anonimizadas de pacientes con COVID-19 con fines científicos.

Cultivo celular de modelos de tejido y tratamiento con ColdZyme®

AEH

El epitelio bronquial humano normal (NHBE, Lonza, cat# CC-2540 S) está disponible en nuestro laboratorio y se cultiva de forma rutinaria en la interfaz aire-líquido (ALI) como se describe [14, 15]. Brevemente, las células se cultivaron en un matraz T75 durante 2 a 4 días hasta que alcanzaron una confluencia del 80 %. Las células se tripsinizaron y se sembraron en 0,33 cm recubiertos con GrowDexT (UPM).² insertos de membrana de poliéster porosos (0,4 μm) con una densidad de siembra de 1 × 10⁵ células por Transwell (Costar, Corning, Nueva York, NY, EE. UU.). Las células se cultivaron hasta casi la confluencia en cultivo sumergido durante 2 a 3 días en un medio de crecimiento de células epiteliales específico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron en atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37 °C y luego se transfirieron a cultivo ALI. El epitelio se expandió y se diferenció utilizando medios para las vías respiratorias de Stemcell™. El número de días de desarrollo se designó en relación con el inicio del cultivo de ALI, correspondiente al día 0. Se aplicó un concentrador de aerosol bucal ColdZyme® en el lado apical del epitelio completamente diferenciado antes de la infección usando BA0.1 o BA0.4/5 . Esto correspondía a aproximadamente 50 µl de líquido, uniformemente dispersos sobre el cultivo de tejidos. La aplicación apical se realizó con cuidado para no romper mecánicamente la superficie epitelial.

Células Vero

VeroE6/TMPRSS2/ACE2 es una línea celular VeroE6 diseñada que expresa altos niveles de TMPRSS2 y ACE2 y es altamente susceptible a la infección por SARS-CoV-2. Esta línea celular se usó para expandir virus BA.1 y BA.4/5 caracterizados de aislados de pacientes. La línea celular se obtuvo a través de CFAR (NIBSC) y se describe en [16].

medición TEER

Los valores TEER se midieron utilizando un voltímetro EVOM con electrodos de palillo STX-2 (World Precision Instruments, Stevenage, Reino Unido). Las medidas de las células en cultivo ALI se tomaron inmediatamente antes de cambiar el medio. Para las mediciones, se agregaron 0,1 ml y 0,7 ml de medio a las cámaras apical y basolateral, respectivamente. Se permitió que las células se equilibraran antes de medir TEER. Los valores de TEER informados se corrigieron para la resistencia y el área superficial de los filtros Transwell.

Tinción y cribado de alto contenido (HCS)

Para visualizar la infección por SARS-CoV-2 en monocapas y modelos de tejido 3D, las células se infectaron con muestras clínicas de SARS-CoV-2 y se analizaron en busca de marcadores característicos en experimentos de infección el día 3 después de la infección (3 ppp). Después de la exposición al SARS-CoV-2, los cultivos de células 3D se fijaron con paraformaldehído al 4 %. La tinción intracelular se realizó con…