Desarrollo preclínico de un nanocuerpo biespecífico trivalente de acción prolongada dirigido a la IL-5 para el tratamiento del asma eosinofílica

by | Nov 19, 2022 | 0 comments

Resumen

Fondo

El asma eosinofílica es un subtipo común de asma grave con alta morbilidad y mortalidad. Se ha demostrado que la citoquina IL-5 es un impulsor clave del desarrollo y la progresión de la enfermedad. Aunque los anticuerpos monoclonales (mAb) aprobados dirigidos a IL-5/IL-5R han demostrado una buena seguridad y eficacia, algunos pacientes tienen respuestas inadecuadas y la dosificación frecuente da como resultado la falta de adherencia a la medicación.

Resultados

Construimos un nuevo nanocuerpo trivalente biespecífico (Nb) que consta de 3 VHH que se unen a 2 epítopos diferentes de IL-5 y 1 epítopo de albúmina derivado de bibliotecas de presentación de fagos inmunizados. Este Nb trivalente de IL-5-HSA exhibió actividades de bloqueo de IL-5/IL-5R similares a las de mepolizumab (Nucala), un mAb aprobado para IL-5. Sorprendentemente, este Nb trivalente fue 58 veces más activo que el mepolizumab en la inhibición de la proliferación de células TF-1. En estudios con primates, la IL-5-HSA Nb trivalente mostró excelentes propiedades farmacocinéticas y los niveles de eosinófilos en sangre periférica permanecieron significativamente suprimidos durante dos meses después de una dosis única. Además, la IL-5-HSA Nb trivalente podría producirse a gran escala en un P. pastoris X-33 sistema de levadura con alta pureza y buena estabilidad térmica.

Conclusiones

Estos hallazgos sugieren que la IL-5-HSA Nb biespecífica trivalente tiene el potencial de ser un agente terapéutico de próxima generación dirigido a la IL-5 para el tratamiento del asma eosinofílica grave.

Gráficamente abstracto

Fondo

El asma eosinofílica es un subtipo común de asma grave con alta morbilidad y mortalidad. [1]. Se caracteriza por la persistencia de eosinófilos en el pulmón y el esputo, lo que resulta en inflamación e hinchazón de las vías respiratorias. [2]. Se ha demostrado que las anomalías de los eosinófilos están asociadas con la producción y liberación de algunos factores inflamatorios solubles, de los cuales la IL-5 es el factor clave para el crecimiento y la diferenciación de los eosinófilos en la médula ósea y la infiltración y activación en los tejidos. [3,4,5]. Se ha demostrado que la expresión de IL-5 aumenta en biopsias bronquiales en pacientes con asma eosinofílica [6, 7]. Además, el nivel de IL-5 en la sangre y los pulmones se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. [8,9,10]. Por lo tanto, el bloqueo de la vía IL-5/IL-5R se considera una estrategia atractiva para el tratamiento del asma eosinofílica.

La FDA ha aprobado varios mAbs dirigidos a la vía IL-5/IL-5R para el tratamiento del asma eosinofílica grave. [11]. Mepolizumab (Nucala) es el primer anticuerpo monoclonal (mAb) aprobado dirigido a la IL-5, que bloquea la unión de la IL-5 a la IL-5Rα, lo que reduce el recuento de eosinófilos en sangre y las exacerbaciones del asma y mejora el control del asma [12]. Reslizumab, otro mAb humanizado de IL-5 aprobado, mostró una eficacia terapéutica similar a la de mepolizumab en el asma eosinofílica grave [13]. Sin embargo, en un estudio de 10 pacientes con asma dependiente de corticosteroides orales, reslizumab fue más eficaz que mepolizumab para reducir la eosinofilia en el esputo. [14]. Benralizumab, el único mAb aprobado dirigido a IL-5R, también reduce la frecuencia de exacerbaciones y mejora la calidad de vida de los pacientes con asma grave [15]. A diferencia de los anticuerpos que se dirigen a la IL-5, benralizumab reduce los eosinófilos de manera más eficiente a través de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, lo que resulta en una mejora de la función pulmonar o el control del asma [16]. Además, GSK3511294, otro mAb de IL-5, con el mismo epítopo de unión a antígeno que mepolizumab, pero con mayor afinidad y vida media más larga, se encuentra actualmente en fase 3 de investigación clínica para el tratamiento del asma eosinofílica grave. [17]. Estos hallazgos sugieren que los productos biológicos dirigidos a IL-5/IL-5R con dosis menos frecuentes, mayor penetración en los tejidos y nuevos mecanismos de acción siguen siendo necesarios para el tratamiento del asma eosinofílica grave.

Los nanocuerpos (Nbs) son fragmentos de anticuerpos de un solo dominio (VHH) derivados de anticuerpos naturales de cadena pesada únicamente en la familia de mamíferos Camelidae. [18]. A diferencia de los anticuerpos tradicionales compuestos por 2 cadenas pesadas y 2 cadenas ligeras, el peso molecular de Nbs es tan pequeño como 15 kD, lo que permite que Nbs muestre una excelente estabilidad y penetración tisular. [19]. Es importante destacar que esta estructura y estabilidad únicas hacen de Nbs los componentes básicos ideales para el desarrollo de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos. [20]. Varios Nbs biespecíficos o triespecíficos basados ​​en Nb informados están en desarrollo clínico para el tratamiento de tumores y enfermedades autoinmunes. [21,22,23,24].

Aquí construimos un nuevo Nb heterobivalente que consiste en 2 Nbs dirigidos a diferentes epítopos de IL-5. Para prolongar la vida media in vivo, este Nb heterobivalente se cargó con una albúmina dirigida a VHH, lo que resultó en un nuevo Nb trivalente. Este Nb trivalente mostró una actividad significativamente mejor que el mepolizumab, un mAb tradicional dirigido a la IL-5, en la inhibición de la proliferación de células TF-1. En estudios con primates, este Nb trivalente mostró excelentes propiedades farmacocinéticas y los niveles de eosinófilos en sangre periférica permanecieron significativamente suprimidos durante 2 meses después de una dosis única. Además, la gran producción del Nb trivalente utilizando el P. pastoris El sistema de expresión tiene una ventaja de costo significativa sobre mAb. Estos hallazgos sugieren que este Nb trivalente tiene el potencial de ser un agente terapéutico de próxima generación dirigido a la IL-5 para el tratamiento del asma eosinofílica grave, con mejor eficacia y dosificación menos frecuente que las terapias actuales anti-IL-5/IL-5R.

materiales y métodos

Líneas celulares

Las células HEK 293T, HEK 293F y TF-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células HEK 293T y HEK 293F se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.) y medio FreeStyle™ 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.), respectivamente, complementado con 10 % de FBS (Gibco) y penicilina-estreptomicina al 1% (10 000 U/mL) (Gibco). Las células TF-1 se cultivaron en RPMI 1640 que contenía FBS al 20 % y 50 U/ml de GM-CSF (Thermo Fisher Scientific).

Inmunización de antígenos y construcción de bibliotecas.

El gen IL-5 se amplificó por PCR y se insertó en el vector pFUSE (Invitrogen). IL-5-Fc se expresó en células HEK-293F y se purificó con cromatografía de afinidad con proteína A. Dos camellos bactrianos machos jóvenes recibieron siete inmunizaciones con IL-5-Fc mezclada con adyuvante de Freund (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.) a intervalos semanales. A partir de entonces, los linfocitos de sangre periférica (PBL) se recolectaron de 100 ml de sangre de camello y luego se produjo una biblioteca de visualización de fagos que contenía genes que codifican para el VHH de acuerdo con los protocolos establecidos. [25, 26]. Se calcularon la capacidad de la biblioteca y las tasas de inserción correctas. Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

Detección, expresión y purificación de Nbs

Los Nbs específicos de IL-5 humana se seleccionaron a través de biopanning de visualización de fagos y ELISA de extracto periplásmico, de acuerdo con los protocolos descritos anteriormente. [21, 23]. Después de secuenciar los clones positivos seleccionados, los fragmentos VHH con diferentes regiones determinantes complementarias 3 (CDR3) clonados en el vector pMECS se transformaron en el no supresor Escherichia coli Cuela las células WK6 y purifícalas mediante cromatografía de afinidad en columnas de afinidad Ni-NTA (Qiagen, Hilden, Alemania).

Preparación de IL-5 Nb bivalente, IL-5-HSA Nb trivalente y análogo de Nucala

El Nb de IL-5 bivalente consiste en dos Nb de IL-5 con diferentes sitios de epítopos que reconocen antígenos, mientras que el Nb trivalente consta de dos Nb de IL-5 y Nb de HSA. Las secuencias de anticuerpos recombinantes se amplificaron y se insertaron en el vector pcDNA3.1+. Posteriormente, los vectores recombinantes se transfectaron en células HEK-293F y la IL-5 Nb bivalente y la IL-5-HSA Nb trivalente se purificaron mediante cromatografía de afinidad Ni-NTA. Para la preparación del análogo de Nucala del anticuerpo de control positivo, las secuencias de ADN de su cadena pesada y su cadena ligera se sintetizaron y clonaron en el vector pcDNA3.1+, y su…

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