Dinámica estacional del microbioma del tracto respiratorio superior en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica

by | Jul 1, 2023 | 0 comments

Shuping Cai,1,2,* Jing Yuan Gao,3,* Xiaomin Liu,3,* junhao yang,3,* Dingyun Feng,1 guijun li,2 sijia li,1 Salve Yang,1 zhang wang,3 Xinzhu Yi,3 yuqi zhou1

1Departamento de Medicina Pulmonar y de Cuidados Críticos, Instituto de Enfermedades Respiratorias, Tercer Hospital Afiliado de la Universidad Sun Yat-Sen, Guangzhou, Guang Dong, República Popular de China; 2Departamento de Medicina Pulmonar y de Cuidados Críticos, Séptimo Hospital Afiliado de la Universidad SUN YAT-SEN, Shenzhen, Guang Dong, República Popular de China; 3Instituto de Ciencias Ecológicas, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Normal del Sur de China, Guangzhou, Guang Dong, República Popular de China

*Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo

Correspondencia: Xinzhu Yi; Yuqi Zhou, correo electrónico [email protected]; [email protected]

Introducción: La creciente evidencia sugiere que los cambios estacionales pueden desencadenar la alternancia del microbioma de las vías respiratorias. Sin embargo, la dinámica de la ecología bacteriana de las vías respiratorias superiores de los pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) en las diferentes estaciones sigue sin estar clara.
Métodos: En este estudio, presentamos una encuesta de ARN ribosomal 16S del microbioma de las vías respiratorias en 72 muestras de hisopos recolectadas en diferentes meses (marzo, mayo, julio, septiembre y noviembre) en 2019 de 18 pacientes con EPOC y de seis pacientes remuestreados en noviembre de 2020 .
Resultados: Nuestro estudio descubrió una microbiota dinámica de las vías respiratorias donde los cambios parecían estar asociados con la alternancia estacional en pacientes con EPOC. Se mostraron doce grupos de patrones temporales mediante análisis diferencial y de agrupamiento a lo largo del curso del tiempo, lo que reveló sistemáticamente distintos taxones microbianos que prefieren crecer en estaciones frías y cálidas, respectivamente. Además, la composición del microbioma de las vías respiratorias superiores fue relativamente estable en la misma temporada en diferentes años.
Discusión: Dada la estrecha asociación entre el microbioma de las vías respiratorias y la progresión de la enfermedad de la EPOC, este estudio puede proporcionar información útil para comprender clínicamente la tendencia estacional de los fenotipos de la enfermedad en pacientes con EPOC.
Gráficamente abstracto:

Palabras clave: enfermedad pulmonar obstructiva crónica, microbioma de las vías respiratorias superiores, variación estacional

Gráficamente abstracto:

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica que provoca la obstrucción del flujo de aire de los pulmones. El advenimiento de la nueva tecnología de secuenciación microbiana independiente del cultivo ha hecho posible revelar la comunidad microbiana compleja del tracto respiratorio y caracterizó una comunidad bacteriana distinta en las vías respiratorias de los pacientes con EPOC en comparación con sujetos sanos.1–3 Varios estudios revelaron diferencias significativas entre el microbioma pulmonar en sujetos sanos y pacientes con EPOC. Por ejemplo, Haldar et al observaron una mayor abundancia de proteobacteriaespecialmente Haemophilus en pacientes con EPOC.4 Liu et al informaron alteración opuesta de la diversidad bacteriana y fúngica en pacientes con EPOC y controles sanos.5 Además, se encontró que la dinámica de la microbiota pulmonar estaba asociada con la exacerbación de la EPOC y los fenotipos inflamatorios de las vías respiratorias. Por ejemplo, una diversidad microbiana alfa reducida en general, un aumento significativo en Moraxella, así como una disminución en la diversidad beta se asociaron con la exacerbación de la EPOC. En los niveles de especie y cepa, H influenzae presiones 86–028NP y pittgg se informó que predice inversamente la inflamación eosinofílica.6–9 Además, las vesículas extracelulares derivadas de bacterias tienen características distintivas en los pulmones de sujetos sanos y pacientes con EPOC, lo que puede conducir a una disfunción inmunitaria e inflamación en la EPOC.10 Estos hallazgos indican que las bacterias pueden desempeñar un papel clave en la patogenia de la EPOC y sugieren que los cambios en la microbiota de las vías respiratorias podrían estar asociados con una mayor inflamación de las vías respiratorias y la progresión de la enfermedad.6–9

Se sabe que la microbiota humana está influenciada por muchos factores ambientales, incluidas las variaciones estacionales. Se ha notado la influencia de la variación estacional en el microbioma del intestino y la piel.11,12 Por ejemplo, Tong et al informaron sobre la variación estacional de la comunidad de hongos en la piel, lo que condujo a una red microbiana de la piel más frágil en otoño que en otras estaciones.12 Asimismo, en los últimos años también se han documentado cambios estacionales del microbioma del tracto respiratorio. Por ejemplo, se ha observado un cambio estacional global en la comunidad bacteriana de las fosas nasales anteriores en 25 voluntarios sanos durante 15 meses, donde el cambio temporal de la abundancia de Propionibacterium acnes y Staphylococcus epidermidis era fuertemente evidente.13 Se informó la variación estacional de la microbiota nasofaríngea de 96 niños sanos, que fue independiente del uso de antibióticos o la coinfección viral.14 La dinámica de la microbiota del tracto respiratorio superior en bebés sanos durante el primer año de vida se describió en otro estudio, donde se informó que la edad y la estacionalidad eran los principales factores que impulsan la variación de la composición de la microbiota nasal.15

Los pacientes con EPOC a menudo experimentan episodios más agudos de empeoramiento de los síntomas y exacerbaciones durante la temporada de invierno del año.dieciséis Esto podría deberse en parte a la fluctuación estacional, ya que se sabe que el cambio estacional afecta las enfermedades respiratorias al influir en la actividad y transmisión viral (por ejemplo, el virus sincitial respiratorio), alterar los vectores, la respuesta inmune del huésped y la disposición de los alérgenos, etc.17,18 Wilkinson et al informaron, a partir de un estudio observacional de cohortes, que el aumento de la etiología de las exacerbaciones agudas de la EPOC en invierno puede deberse a una mayor presencia de patógenos, así como a una interacción entre los no tipificables Haemophilus influenzae infección de las vías respiratorias e infección viral.19 Sin embargo, a estas alturas, todavía sabemos poco sobre la dinámica de la ecología bacteriana de las vías respiratorias superiores de los pacientes con EPOC en las diferentes estaciones. Una mejor comprensión de la estacionalidad de la microbiota de las vías respiratorias de la EPOC, especialmente los patógenos, puede permitirnos implementar futuras intervenciones de salud pública e impartir oportunidades para las terapias clínicas de la EPOC.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que la composición del microbioma de las vías respiratorias superiores en pacientes con EPOC podría alterarse con las estaciones. Con este fin, realizamos una encuesta de microbioma basada en 16S rRNA en 72 muestras de hisopos recolectadas de 18 pacientes con EPOC durante 5 meses (marzo, mayo, julio, septiembre y noviembre) en 2019 y de 6 pacientes remuestreados en noviembre de 2020, y aplicó análisis diferenciales y de agrupamiento para revelar distintos patrones estacionales de la microbiota de las vías respiratorias superiores en pacientes con EPOC.

Materiales y métodos

Adquisición de sujetos y muestras

Dieciocho pacientes con EPOC (diagnosticados según los criterios GOLD,20 edad > 40 años) fueron reclutados. Se recolectó y procesó un total de 72 muestras de hisopos orofaríngeos, incluidas 66 recolectadas en marzo, mayo, julio, septiembre y noviembre de 2019 y 6 de pacientes remuestreados en noviembre de 2020 (detallado en Tabla S1).

Secuenciación de ARNr 16S y análisis de microbiomas

El ADN genómico bacteriano se extrajo de los hisopos con el kit Qiagen DNA Mini (Qiagen, EE. UU.) según el protocolo del fabricante a partir de muestras de hisopos. El rendimiento y la pureza del ADN extraído se evaluaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). La región hipervariable V4 del gen 16S rRNA luego se amplificó por PCR con los controles de reactivo apropiados para evitar la contaminación introducida en el experimento. Los fragmentos de ADN amplificados se secuenciaron utilizando la plataforma Illumina MiSeq. Las lecturas de secuenciación se procesaron utilizando la tubería QIIME V.2.0.21 Se eliminó el ruido de las secuencias y se identificaron las variantes de secuencia de amplicón (ASV) utilizando el algoritmo dada2. La taxonomía se asignó a los ASV utilizando el clasificador de taxonomía q2-feature-classifier classify-sklearn Naïve Bayes contra Greengenes_13_8 en un límite del 99 % de unidades taxonómicas operativas (OTU). Los datos de secuencia están depositados en el Centro Nacional de Información Biotecnológica bajo PRJNA909340. Para obtener perfiles funcionales microbianos, PICRUSt222 se utilizó para predecir la abundancia de KEGG Orthology a partir de datos de secuenciación del gen 16S rRNA.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos y la visualización se realizaron con el software R (versión 3.6). La diversidad alfa se evaluó mediante el índice de Shannon. La diversidad beta se generó en función de la distancia UniFrac ponderada23 de perfiles OTU o perfiles KO en cada muestra y visualizados mediante gráficos de análisis de componentes principales (PCA). Se utilizó ANálisis de SiMilaridades (ANOSIM) para probar la significancia estadística de los perfiles OTU o perfiles KO entre diferentes meses. Se usó la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis para probar las diferencias de taxón individual o KO en diferentes meses. El análisis diferencial, el análisis de agrupamiento y la visualización de los patrones temporales de los datos del microbioma se realizaron utilizando el algoritmo fuzzy c-means con la función timeclust del paquete TCseq. El análisis de Procrustes se llevó a cabo utilizando vegan24 paquete en r

Resultados

El microbioma de las vías respiratorias superiores de la EPOC y las características funcionales microbianas fueron diferentes entre los diferentes meses del año

Se recolectó un total de 66 muestras de hisopos de 18 sujetos durante 5 meses (marzo, mayo, julio, septiembre y noviembre) en 2019. El tamaño de la muestra de cada sujeto varía de 2 a 5 (Tabla S1, Figura S1). Los espacios en blanco de extracción se presentaron con distintos perfiles microbianos de las muestras, lo que indica un efecto insignificante de la contaminación (Figura S2). Se identificaron un total de 6110 OTU a partir de estas muestras después de realizar la rarefacción. En general, PCA no reveló diferencias significativas del perfil microbiano en diferentes meses (Figura 1aAnosimR2 = 0.057, PAG = 0,63). Se encontró un aumento moderado de la diversidad alfa (Figura 1b) en julio en comparación con otros meses, lo que sugiere un microbioma más diverso en julio. La mayoría de las OTU pertenecían al género de Estreptococoseguido por Prevotella y Neisseria (Figura 1c). Un aumento significativo (FDR < 0,05, prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis) de Helicobacteraceae, Clostridium, Oscillospira, Brevibacillus, Proteus y Weissella En Mayo, Enhydrobacter, Metilobacteriaceaey Brevibacillus en noviembre, Proteo en marzo, Brevibacillus en julio y septiembre (Figura 1d) fueron reconocidos, revelando la preferencia de diferentes microbiotas para proliferar en diferentes estaciones en las vías respiratorias de los pacientes con EPOC.

Figura 1 La composición del microbioma de las vías respiratorias de los pacientes con EPOC cambió con los meses. (a) Análisis de componentes principales (PCA) del microbioma agrupado por meses de muestreo (b). Composición del microbioma a nivel de género en diferentes meses. (C) Diversidad alfa (Shannon) del microbioma de las vías respiratorias en diferentes meses. (d) Microbioma con abundancia relativa significativamente cambiada en diferentes meses (PAG <0,05). Se usó la prueba de suma de rangos de Kruskal-Wallis para probar las diferencias de las UTO en diferentes meses.

Los perfiles funcionales de la comunidad microbiana se infirieron a partir de las secuencias del gen 16S rRNA utilizando PICRUSt2. Similar a la composición microbiana, la variación estacional de los perfiles de función general fue insignificante (Figura S3aAnosimR2 = 0.059, PAG = 0.52), y las funciones microbianas estuvieron dominadas consistentemente por el metabolismo de carbohidratos, aminoácidos, cofactores, vitaminas, etc.Figura S3b). La abundancia de 14 KO se alteró significativamente (FDR < 0,05) por mes después del ajuste del valor de p en todas las pruebas de Kruskal-Wallis, incluidos nueve genes asociados a la formación de esporas, un gen de resistencia a los antimicrobianos, dos genes transportadores de dipéptidos y dos genes asociados al metabolismo de aminoácidos (Figura S3c). La abundancia de estos KO fue significativamente mayor en septiembre y noviembre que en otros meses.

Dinámica estacional del microbioma de las vías respiratorias superiores de la EPOC

Para dilucidar aún más las principales tendencias de los cambios microbianos con las estaciones, aplicamos análisis diferenciales y análisis de agrupamiento a lo largo del tiempo a nuestro conjunto de datos. Finalmente, se generaron 12 conglomerados y el número de taxones en cada conglomerado varió de 10 a 84 (Tabla S2). Cada grupo exhibe un patrón de variación temporal distinto (

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