Efectos de las nanovesículas derivadas de células madre mesenquimales en la inflamación alérgica experimental de las vías respiratorias

by | Ene 6, 2023 | 0 comments

Abstracto

Antecedentes

El asma alérgica se asocia con la obstrucción del flujo de aire y la hiperreactividad que surge de la inflamación y remodelación de las vías respiratorias. Se ha demostrado que la terapia celular con células madre mesenquimales (MSC) atenúa la inflamación en modelos de asma, y ​​recientemente se han observado efectos similares utilizando vesículas extracelulares (EV) obtenidas de estas células. Las vesículas biológicamente funcionales también se pueden generar artificialmente a partir de MSC mediante la extrusión de células a través de membranas para producir nanovesículas miméticas de EV (NV). En este estudio, nuestro objetivo fue determinar los efectos de diferentes vesículas derivadas de MSC en un modelo murino de inflamación alérgica de las vías respiratorias.

Métodos

Las EV se obtuvieron mediante centrifugación secuencial de medios sin suero acondicionados con MSC de médula ósea humana durante 24 h. NV se produjeron a través de la extrusión en serie de las células enteras a través de filtros. Ambos tipos de vesículas se sometieron a una purificación en gradiente de densidad y se cuantificaron mediante un análisis de seguimiento de nanopartículas. Los ratones C57BL/6 se sensibilizaron a la ovoalbúmina (OVA, 8 µg) y luego se dividieron aleatoriamente en el grupo OVA (expuestos por vía intranasal a 100 µg de OVA durante 5 días) y el grupo control (expuestos a PBS). Luego, los ratones se dividieron en grupos que recibieron 2 × 109 EV o NV (por vía intranasal o intraperitoneal) o PBS inmediatamente después de la primera exposición a OVA.

Resultados

La administración de EV y NV redujo la celularidad y la eosinofilia en el líquido de lavado broncoalveolar (BAL) en ratones sensibilizados con OVA y expuestos a OVA. Además, el tratamiento con NV resultó en una disminución del número de células inflamatorias dentro del tejido pulmonar, y esto se asoció con niveles más bajos de eotaxina-2 tanto en el líquido del LBA como en el tejido pulmonar. Además, tanto la administración intranasal como la sistémica de NV fueron eficaces para reducir las células inflamatorias; sin embargo, la administración sistémica resultó en una mayor reducción de la eosinofilia en el tejido pulmonar.

Conclusiones

En conjunto, nuestros resultados indican que la NV derivada de MSC reduce significativamente la inflamación alérgica de las vías respiratorias inducida por OVA a un nivel comparable a la EV. Por lo tanto, la NV derivada de células puede ser un nuevo candidato terapéutico mimético de EV para tratar enfermedades alérgicas como el asma.

Antecedentes

El asma es una enfermedad inflamatoria crónica asociada con obstrucción del flujo de aire, hiperreactividad bronquial y síntomas respiratorios como sibilancias y dificultad para respirar. [1]. A pesar del impacto amplio y pesado del asma en todo el mundo, existen relativamente pocas opciones de tratamiento para pacientes con asma mal controlada a pesar de ser tratados con corticosteroides inhalados y agonistas β de acción prolongada. [2]. Es importante destacar que los corticosteroides inhalados no tienen ninguna capacidad intrínseca para inducir la reparación de los cambios estructurales causados ​​por la remodelación de las vías respiratorias de los asmáticos. Por lo tanto, los enfoques terapéuticos tanto para atenuar la inflamación como para mejorar los procesos de remodelación pueden tener un lugar en el manejo clínico.

En la búsqueda de una terapia que pueda reducir la inflamación y mejorar la remodelación de las vías respiratorias, las células madre mesenquimales (MSC) se han mostrado prometedoras como una nueva estrategia para atenuar la inflamación y restaurar el equilibrio de los procesos de reparación, evitando así la remodelación nociva. [3]. Las MSC son capaces de promover efectos inmunomoduladores en una amplia gama de enfermedades respiratorias, incluso en modelos de trasplante xenogénico [4]. Sin embargo, el tratamiento con células completas conlleva algunas preocupaciones porque las células completas pueden comenzar a proliferar y diferenciarse en el paciente receptor.

Anteriormente se ha demostrado que el medio acondicionado de MSC posee efectos terapéuticos similares a los de las MSC completas, en parte debido a la presencia de vesículas extracelulares (EV) [5, 6]. Estas vesículas son secretadas de forma ubicua por las células en cultivo, incluso sin estimulación, y contienen moléculas clasificadas específicamente que incluyen estructuras subcelulares, proteínas y ácidos nucleicos. Se ha centrado mucho interés en estas vesículas debido a su capacidad para promover cambios en las células y tejidos diana. [7]. Alternativamente, las nanovesículas (NV) miméticas de EV se pueden generar a través de extrusiones en serie de células [8]. El contenido de estas vesículas es una variedad aleatoria de moléculas, pero aún pueden desencadenar respuestas en las células objetivo de manera similar a EV. Es importante destacar que el contenido de la membrana biológica de NV sugiere que podría ser una alternativa adecuada a EV con la ventaja de mayores rendimientos. [8]. Las terapias basadas en vesículas pueden superar los problemas de seguridad relacionados con el tratamiento con células enteras y pueden reducir la necesidad de procedimientos invasivos repetidos.

Estudios anteriores han demostrado que las EV derivadas de MSC humanas tienen propiedades terapéuticas en un modelo de inflamación alérgica de las vías respiratorias [5, 9], pero no existe ningún informe que describa si la NV derivada de estas células tiene efectos antiinflamatorios similares a los de la EV. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo comparar la eficacia de la NV fabricada con la de la EV aislada de MSC humana sobre la inflamación en un modelo experimental de inflamación alérgica de las vías respiratorias inducida por ovoalbúmina (OVA) y explorar más a fondo si la administración local o sistémica de estas vesículas tiene algún efecto terapéutico. ventajas

Métodos

Protocolos de cultivo celular y aislamiento de vesículas

Se obtuvieron MSC primarias derivadas de médula ósea humana del Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine [10]. Las células se cultivaron en medio alfa MEM suplementado con suero bovino fetal al 15 % (HyClone Laboratories) y solución antibiótica al 1 % (100 unidades/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina, HyClone Laboratories), y todas las células se utilizaron entre el tercer y el quintos pasajes. Seguimos un protocolo de uso común para el aislamiento de EV a través de la ultracentrifugación de los medios acondicionados seguido de la purificación en gradiente de densidad de las muestras. [11]. Para el aislamiento de NV, después de 24 h de incubación en medio sin suero, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y se separaron de los frascos de cultivo celular usando PBS que contenía EDTA 10 mM. MSC se resuspendieron a una densidad de 5 × 106 células por ml en un total de 10 ml de PBS. Las suspensiones celulares se pasaron cinco veces a través de una serie de filtros de membrana de policarbonato (Whatman) con tamaños de poro de 10 µm, 5 µm y 1 µm utilizando una miniextrusora (Avanti Polar Lipids). Se añadió secuencialmente un total de 1 ml de yodixanol al 50 % (Axis-Shield PoC AS) y 2 ml de yodixanol al 10 % a cada tubo de ultracentrífuga de 10 ml, seguido de 7 ml del efluente de suspensión celular del filtro de membrana. Las capas se formaron entre 50 % de iodixanol y 10 % de iodixanol después de la ultracentrifugación a 100 000 ×gramo durante 2 h fueron recolectados y considerados NV.

Caracterización de EV y NV

EV y NV se dispersaron en PBS a la concentración óptima para la medición, y luego se midieron las concentraciones de partículas utilizando el analizador ZetaView (Particle Metrix GmbH, versión de software 8.2.30.1). Las mediciones se evaluaron por duplicado y cada conjunto de datos individual se obtuvo de dos capas estacionarias con 11 mediciones en cada capa. La sensibilidad de la cámara se fijó al 80% en todas las mediciones. Para la microscopía electrónica de transmisión (TEM), las rejillas de cobre recubiertas de formvar/carbono (Ted Pella, Inc., Redding, CA, EE. UU.) se descargaron con brillo antes de cargar las muestras. Las rejillas y las muestras se incubaron durante 15 min antes de fijarlas en paraformaldehído al 2 % y en glutaraldehído al 2,5 % con lavados de PBS en el medio. Las muestras luego se lavaron en dH2O y luego se contrastaron en acetato de uranilo al 2%. Las preparaciones se examinaron utilizando un microscopio electrónico LEO 912AB Omega (Carl Zeiss NTS, Jena, Alemania).

Análisis de genes y proteínas de EV y NV

El ARN de EV o NV se aisló utilizando un kit de aislamiento de ARN miRCURY para biofluidos (Exiqon) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN se aisló usando un kit Qiamp DNA Blood Mini (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se analizó la calidad, el rendimiento y la longitud de nucleótidos de un microlitro de ARN y ADN aislados por capilaridad…

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