Efectos de Z-VaD-Ala-Asp-Fluoromethyl Ketone (Z-VAD-FMK) y Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-Aldehyde(Ac-DEVD-CHO) sobre la inflamación y la secreción de moco en ratones expuestos al humo del cigarrillo

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad común, prevenible y tratable caracterizada por una limitación persistente del flujo de aire y síntomas respiratorios. Las anomalías de las vías respiratorias y/o alveolares causadas por una exposición significativa a partículas o gases nocivos son las principales causas de la EPOC.^1,2 Además, el enfisema, la remodelación, la inflamación de las vías respiratorias y la alta secreción de moco son las principales bases patológicas de la EPOC.^3–5 Estudios previos detectaron un mayor estrés oxidativo e inflamatorio en pacientes con EPOC.⁵ Además, varios mecanismos, que incluyen el exceso de producción debido a la inflamación, la disminución de la eliminación debido al deterioro de la limpieza ciliar y la reducción de la eficacia de la tos, se han asociado con la secreción de moco.^6,7 En pacientes con EPOC que fuman, esta condición puede agravarse aún más; el humo del cigarrillo (CS) altera el transporte mucociliar al inducir la deshidratación de las vías respiratorias y aumentar la viscosidad del moco.^4,8 Sin embargo, el mecanismo molecular exacto asociado con este proceso (es decir, la inflamación y la producción de mucosidad, particularmente cuando se asocia con SC en pacientes con EPOC) aún no se comprende bien.

El inflamasoma de la proteína 3 del receptor similar al dominio de unión a nucleótidos (NLRP3) es un importante receptor de reconocimiento de patrones dentro del citoplasma. Los estudios han encontrado que los cigarrillos pueden activar NLRP3 y caspasa-1 y promover la expresión y liberación de interleucina (IL)-1β e IL-18, lo que da como resultado brotes inflamatorios que pueden provocar enfisema y proliferación de células mucosas, promoviendo así la formación de EPOC.^9–11 Sin embargo, otros estudios¹² han demostrado que los cuerpos inflamatorios NLRP3 no tienen efecto inhibitorio sobre la patogenia de la EPOC, por lo que se necesita más investigación en esta área, y estos estudios^9–12 apoyar aún más la justificación de los estudios para mejorar nuestra comprensión de la patogenia de la EPOC y puede ser importante apuntar a los mediadores de señalización aguas abajo en lugar del propio NLRP3. Además, la activación de NLRP3/caspasa-1 activa la expresión de caspasa-3 y promueve la expresión de IL-8,¹³ e IL-8 promueve la expresión de mucina 5ac (Muc5ac) en las células epiteliales de las vías respiratorias de manera dependiente de la concentración.¹⁴ Sin embargo, no se ha demostrado claramente la correlación entre la vía NLRP3 y la IL-8.

En este estudio, el inhibidor de pan-caspasa z-VaD-Ala-Asp-fluorometilcetona (Z-VAD) y el inhibidor de caspasa-3 acetil-Asp-Glu-Val-Asp-aldehído (Ac-DEVD) se utilizaron para investigar el efecto de la inhibición de la caspasa en la expresión de IL-1β e IL-8, la inflamación de las vías respiratorias y la secreción de moco en ratones expuestos a CS.

Materiales y métodos

animales

Treinta y dos ratones C57BL/6J macho de 6 a 7 semanas de edad se obtuvieron de GemPharmatech Co., Ltd, China (Certificado n.º: 202104256). Todos los animales habían sido criados en las instalaciones para animales de JRDUN Biotechnology (una sucursal de Shanghai Rat & Mouse Biotech Co., Ltd) y se alojaron en un ambiente con una temperatura de 22 °C ± 1 °C, una humedad relativa de 50% ± 1%, y un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h, donde se les alimentó y bebió ad libitum. Todos los estudios (incluido el procedimiento de eutanasia de ratones) se realizaron de conformidad con las normas y directrices del Comité de Ética de Investigación Biomédica de la Sucursal de Wusong del Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Guía para el cuidado y la salud de los Institutos Nacionales de Salud. Uso de animales de laboratorio.¹⁵

Exposición al humo del cigarrillo

Los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (ocho ratones/grupo): un grupo de control, el grupo Smoke (solo expuesto a CS), el grupo Z-VAD (expuesto a CS + Z-VAD) y el grupo Ac-DEVD (expuesto a CS + Ac-DEVD). Con excepción del grupo de control, los animales fueron expuestos a CS de cinco cigarrillos (alquitrán: 13 mg/cig; nicotina: 1,0 mg/cig; óxido carbónico: 14 mg/cig; Daqianmen, Shanghai, China) 15 minutos cada vez, cuatro veces al día, y los dos períodos de humo tenían un intervalo de 30 minutos. La exposición al humo del cigarrillo se realizó cada dos días durante tres meses.

Administración de inhibidores de Caspasa-1 y Caspasa-3

El inhibidor de pan-caspasa Z-VAD (Beyotime, Shanghái, China) y el inhibidor de caspasa-3 Ac-DEVD (Beyotime, Shanghái, China) se reconstituyeron en dimetilsulfóxido y se diluyeron según las instrucciones del proveedor. Ambos compuestos se administraron a una dosis de 3 mg/kg por vía intraperitoneal 1 h antes de la exposición a CS (cada dos días).

Pruebas de función pulmonar

Después de tres meses de exposición al humo, se evaluó la función pulmonar con un instrumento de función pulmonar invasivo para medir la resistencia total de las vías respiratorias (resistencia pulmonar), la distensibilidad dinámica pulmonar y la ventilación máxima por minuto (MVV). Los ratones se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg). Después de desinfectar la piel del cuello, se cortó y el tejido subcutáneo se separó con disección roma. Se expuso la tráquea, se hizo una incisión transversal y se implantó una aguja de cánula venosa (de unos 5-6 mm de profundidad) y se fijó con una sutura. Luego, los ratones se colocaron en una caja de pletismógrafo corporal (AniRes2005, Beilanbo, Beijing, China) y se conectaron a una máquina de ventilación mecánica para animales pequeños. Se utilizaron los siguientes parámetros: volumen corriente (7 ml/kg), frecuencia respiratoria (90 veces/min) y relación inspiratoria-espiratoria (10:20). Una vez configurada la ventilación, se midió la función de ventilación pulmonar.

Procedimientos de lavado

Después de que se completó la prueba de función pulmonar, se sacrificó a los ratones, se les abrió el pecho y se ligó el bronquio principal izquierdo. Se inyectó un volumen de 0,7 ml de solución salina en el pulmón derecho para lavado alveolar tres veces. La recuperación fue de alrededor del 60% al 70%. El BALF se colocó directamente en un analizador de esferas de sangre totalmente automatizado para el recuento y la clasificación de células, después de lo cual se centrifugó a 1000 r·min.⁻¹ durante 10 min. A continuación, se recogió el sobrenadante y se almacenó a -80 °C para un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Mediciones morfométricas de vías respiratorias y tejido pulmonar

El tejido del lóbulo superior del pulmón izquierdo se fijó en formaldehído al 4 % durante 24 h, se incluyó en parafina, se cortó en secciones de 5 µm de espesor y se tiñó con hematoxilina y eosina (Biovisualab, Shanghái, China). La infiltración de células inflamatorias y los cambios estructurales del alveolo pulmonar del tubo bronquial se verificaron por histopatología. El intercepto alveolar se midió aleatoriamente en cinco campos visuales de gran aumento para cada pieza patológica, evitando la vía aérea y los vasos sanguíneos, y se contó el número de alvéolos en el alambre cruzado. La intersección alveolar promedio (AAI) se calculó como la longitud del cable dividida por el número de alvéolos. Se realizó una tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) para detectar la secreción de moco en las vías respiratorias.

Niveles de suero y líquido de lavado broncoalveolar, interleucina-1β, interleucina-8 y mucina 5ac

Se recogieron muestras de sangre de los ojos y se centrifugó un total de 0,8 a 1 ml de sangre a 4000 r·min.⁻¹ durante 10 min. Se eliminó el sobrenadante y se almacenó a -80 °C para su análisis. R&D Systems (EE. UU.) suministró kits ELISA para detectar los niveles de IL-1β, IL-8 y Muc5ac, y la detección ELISA del sobrenadante de suero y BALF se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico

El procesamiento estadístico se realizó con el software SPSS (versión 22.0). Los gráficos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 5.0). Los datos de medición que obedecían a la distribución normal se analizaron mediante análisis de varianza y los datos se presentaron como media ± desviación estándar para cada grupo experimental. Los datos con una distribución no normal se analizaron utilizando el Kruskal-Wallis H-test y presentado como cuartiles. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Condiciones generales

En comparación con los ratones de control, los animales expuestos al humo se agruparon más, reaccionaron más lentamente, estaban letárgicos y tenían el pelaje opaco. Dos de los ratones del grupo Z-VAD murieron.

Evaluaciones funcionales pulmonares

Los ratones del grupo Smoke mostraron una mayor resistencia de las vías respiratorias de los pulmones y una disminución de la distensibilidad pulmonar, pero la diferencia no fue estadísticamente significativa en comparación con los otros tres grupos (PAG > 0.05, Figuras 1A y B). El grupo Z-VAD mostró menor resistencia de las vías respiratorias y mayor cumplimiento que los grupos control y Smoke. El grupo Ac-DEVD exhibió una mayor resistencia de las vías respiratorias que el grupo de control, pero no hubo una diferencia significativa (PAG > 0.05, Figuras 1A y B).

Figura 1 Evaluación de la función pulmonar tras la exposición al humo y el tratamiento con el inhibidor de caspasa-1 Z-VAD-fluorometilcetona o el inhibidor de caspasa-3 Ac-DEVD-CHO. (A) La resistencia de las vías respiratorias fue mayor en el grupo de humo y menor en el grupo de Z-VAD, pero con un valor de p > 0,05. (B) La distensibilidad pulmonar dinámica disminuyó en el grupo Smoke y aumentó en el grupo Z-VAD en comparación con el control. (C) MVV fueron más bajos en el grupo de humo. Los valores son la media ± SD para la resistencia de las vías respiratorias y MVV….