El bloqueo de la expresión de RAGE después de una lesión reduce la inflamación en un modelo de ratón con lesión pulmonar aguda

Fondo

El receptor para productos finales glicosilados avanzados (RAGE) juega un papel importante en la respuesta inflamatoria a la lesión pulmonar aguda inducida por infecciones e infecciones. Probamos la hipótesis de que un anticuerpo bloqueador de RAGE, cuando se administra después del inicio de la lesión, puede reducir la inflamación pulmonar en comparación con el anticuerpo de control.

Métodos

Se utilizaron ratones macho y hembra C57BL/6 (WT). Cuarenta y seis recibieron lipopolisacárido (LPS) y 26 PBS por instilación nasal el día uno, repitiendo el día tres. El día 2, 36 ratones que recibieron LPS se dividieron en dos grupos de 18, uno tratado con 200 μg de control de isotipo no inmune IgG y el segundo grupo tratado con 200 μg de anti-RAGE Ab, cada dosis dividida entre IV e IP. Diez de los 46 no fueron tratados. El día 4, antes de la eutanasia, se inyectó a los ratones albúmina marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Se recogieron muestras de suero y BALF, así como tejido pulmonar para inmunohistoquímica (IHC). BALF se analizó en cuanto a recuentos de células (leucocitos), proporciones FITC BALF/suero que indican fuga vascular pulmonar y citocinas/quimiocinas utilizando ensayos multiplex basados ​​en perlas. Se realizó IHC cuantitativa para MPO y RAGE.

Resultados

Diez ratones LPS mostraron una inflamación mínima según todas las medidas, lo que indica una administración deficiente de LPS y se excluyeron del análisis dejando n = 11 en el grupo LPS + IgG y n = 12 en el grupo LPS + anti-RAGE. Los recuentos de células BALF fueron bajos en los ratones administrados con PBS (4,9 ± 2,1 × 10⁵/ml) y alto en los ratones lesionados con LPS no tratados (109 ± 34) y en los ratones LPS + IgG (91 ± 54) mientras que, en comparación, los recuentos de ratones LPS + anti-RAGE ab fueron significativamente más bajos (51,3 ± 18 frente a LPS + IgG, P = 0,03). Las proporciones de BALF/FITC en suero fueron más bajas para los ratones LPS + anti-RAGE que para los ratones LPS + IgG, lo que indica una menor fuga capilar. La tinción cuantitativa de IHC RAGE fue menor en los ratones LPS + anti-RAGE ab que en los ratones tratados con LPS + IgG (P = 0,02).

Conclusiones

Estos resultados describen un protocolo de LPS de cuatro días para sostener la lesión pulmonar y permitir el tratamiento y sugieren que el tratamiento dirigido a bloquear RAGE cuando se administra después del inicio de la lesión puede reducir la inflamación pulmonar.

El receptor para productos finales glicosilados avanzados (RAGE) es un receptor multiligando que se encuentra en el epitelio bronquiolar, los neumocitos alveolares tipo II y los macrófagos alveolares. [1]. En respuesta a agentes infecciosos, como la influenza y la neumonía, los ligandos inflamatorios, incluidos los productos finales de glicación aguda (AGE), las calgranulinas S100 y la caja de grupo 1 de alta movilidad (HMGB1), se unen a RAGE. Esta unión activa vías aguas abajo que median patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS) y patrones moleculares asociados a daños (DAMPS) que perpetúan y amplifican la respuesta inflamatoria que desencadena la lesión pulmonar aguda (ALI) y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) [2,3,4]. Los niveles de ligandos RAGE están elevados en los sueros de pacientes con neumonía viral, incluido Covid-19 con ARDS, y se asocian con un mal resultado [5,6,7,8,9]. Hay un informe publicado que investiga la eficacia de un anticuerpo bloqueador RAGE para reducir la inflamación pulmonar en un modelo de ratón con lesión pulmonar aguda. [10]. Se indujo la lesión por inhalación de ácido y se administró el anticuerpo antes de la lesión. Los resultados mostraron que tanto un anticuerpo anti-RAGE como sRAGE soluble, el dominio extracelular escindido del receptor que actúa como señuelo, redujeron la lesión pulmonar. Dado que el tratamiento se administró antes de la lesión, los resultados no son directamente aplicables a la situación clínica en la que el tratamiento se administró después de que se estableció la lesión pulmonar y continúa. Para permitir la administración del fármaco después del inicio de la lesión, modificamos el modelo estándar de lesión de LPS de dosis única para incluir una ventana de tratamiento que permita el tratamiento después del inicio de la lesión.

En nuestro protocolo de administración de LPS revisado, administramos LPS mediante instilación nasal a ratones el día uno y el día tres, los tratamos el día dos y sobrevivimos a los ratones hasta el día cuatro. Esto nos permitió comparar los regímenes de tratamiento en ratones lesionados con ratones de control emparejados que recibieron instilación nasal de PBS y seguir la supervivencia, los pesos y cuantificar la lesión pulmonar y la fuga capilar.

animales

Los procedimientos que involucran el uso de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (Universidad de Columbia). Para todos los experimentos, se obtuvieron ratones C57/BL6 machos y hembras de 6 a 8 semanas de edad de Jackson Laboratories (Ellsworth, ME). Se utilizaron los siguientes grupos de ratones: ratones C57BL/6 (WT) con lesión LPS sola (n = 10) y control de lesión (PBS) (n = 8), ratones WT LPS tratados con anti-RAGE ab (n = 18) con 6 controles de PBS, LPS WT tratado con IgG de control de isotipo coincidente no inmune (n = 18) con 12 controles de PBS. Los ratones se pesaron diariamente.

administración de LPS

Se disolvió LPS derivado de Escherichia coli O111:B4 (Sigma Chemical) en PBS estéril y libre de endotoxinas (GIBCO) en condiciones estériles. Los ratones se anestesian con isoflurano y se administra LPS (1,5 mg/kg) mediante instilación nasal usando una micropipeta. Las dosis de LPS se repitieron el día 3 y los ratones se sacrificaron el día 4. Se administró PBS mediante instilación nasal en ratones emparejados en los grupos de tratamiento.

anticuerpos

El anticuerpo anti-RAGE se produjo inicialmente usando un péptido inmunizante que contenía una secuencia AA única en el dominio V de la porción extracelular del anticuerpo. Se produjeron anticuerpos monoclonales murinos mediante tecnología de hibridoma y posteriormente se humanizó el ab y se produjo el isotipo IgG1 humanizado usando el proceso intermediario de anticuerpo quimérico. El ADNc del anticuerpo se clonó y expresó en células de mamífero (ExpiCHO-S) y luego se produjo un anticuerpo a gran escala utilizando tecnología de plásmidos (Fair Journey Biologics, Porto Portugal). Las pruebas con este anticuerpo revelaron lo siguiente. Mediante análisis FACS, el anticuerpo se unió a células de varias líneas celulares que expresan RAGE. Redujo significativamente la fosforilación de AKT inducida por S100B en las células del músculo liso aórtico en respuesta a la dosis, e inhibió la secreción de TNFα e IL-1b inducida por S100B en respuesta a la dosis. Inhibía la secreción de IL-6 inducida por HMGB1 de las células de la médula ósea periférica humana. Las secuencias peptídicas de este anticuerpo son las mismas que las del anticuerpo denominado CR-3 en nuestras publicaciones recientes. [11, 12].

Administración de Drogas

Se permitió que los animales se recuperaran durante 24 h después de la lesión antes de la administración de cualquier tratamiento farmacológico. La dosis de anti-RAGE ab o IgG no inmune de control de isotipo (200 µg) se dividió entre la administración IV e IP (volumen de 200 µl por dosis dividida). Los animales son monitoreados de cerca por cambios en el apetito, pérdida de peso y dificultad respiratoria.

Eutanasia

En el día 4 (24 h después de la última dosis de LPS), los ratones se sacrificaron con isoflurano seguido de dislocación cervical. Dos horas antes de la eutanasia, se inyectó a los ratones albúmina marcada con FITC (Sigma-Aldrich, nº A9771) para evaluar la posible fuga vascular pulmonar. Se toman pulmones, suero y BALF (líquido de lavado broncoalveolar) para su análisis. Brevemente, se abrió el tórax, se canuló el ventrículo derecho y se extrajeron aproximadamente 250 µl de sangre. Se extrajo el BALF y se congeló rápidamente el pulmón derecho para su posterior análisis. Se tomó una muestra de sangre y se centrifugó para separar y recolectar el suero para almacenamiento congelado. El pulmón izquierdo se conservó en formalina al 10 % para incluirlo en parafina, seccionarlo y teñirlo posteriormente.

Análisis BALF

Las muestras BALF se centrifugaron (Cytospin 4 Thermo Scientific) y el sobrenadante se congeló para el análisis de citoquinas. Los sedimentos de células se colocaron en un instrumento de recuento de células (Countess, Invitrogen Thermo fissure Scientific) para contar las células vivas. Se prepararon portaobjetos de las células centrifugadas, se tiñeron con DifQuik (Polyscience) y se examinaron al microscopio para confirmar que eran neutrófilos. Los resultados se expresaron como células × 10⁵/ml.

Las muestras de suero y BALF se cargaron en placas de pocillos y las lecturas de intensidad de fluorescencia…