El d-limoneno inhibe la aparición y progresión de LUAD mediante la supresión de la acumulación de gotas de lípidos inducida por la exposición a PM2.5 in vivo e in vitro

Fondo

PM_2.5 la exposición se asocia con adenocarcinoma de pulmón (LUAD), pero el mecanismo no está claro. La falta de comprensión impide nuestro esfuerzo de prevención. Este estudio examinó un posible mecanismo de cáncer de pulmón causado por PM_2.5 exposición, y tenía como objetivo encontrar una intervención potencial para las personas que viven en PM_2.5 regiones contaminadas.

Métodos

Se realizaron microscopía electrónica y tinción con aceite rojo para examinar la acumulación de gotas de lípidos. Se realizaron la tinción tricrómica de Masson, la formación de colonias, el ensayo de raspado y el experimento Transwell para evaluar el efecto de PM_2.5 exposición y d-intervención con limoneno en la aparición y progresión de LUAD. Los objetivos de intervención potenciales fueron encontrados por RNA-Seq y verificados por el ensayo de indicador de luciferasa. MiR–Se utilizaron 195 ratones KO construidos con tecnología CRISPR/Cas9 para investigar el papel fundamental de d-eje limoneno-miR-195-SREBP1/FASN. También se realizaron análisis de cohortes de pacientes con cáncer de pulmón, tinción de tejidos LUAD humanos y ensayos de intervención humana para validar los resultados de los experimentos con células y animales.

Resultados

Nuestros resultados mostraron que PM_2.5 la exposición indujo la acumulación de gotas de lípidos en las células LUAD que se acompañó de un aumento de los comportamientos celulares malignos. PM_2.5 la exposición condujo a la translocación de N-SREBP1 escindida en el núcleo, lo que activó la vía de lipogénesis de novo. También se observaron los mismos cambios en las células epiteliales pulmonares normales y en el tejido pulmonar normal, y los ratones desarrollaron fibrosis pulmonar después de una exposición prolongada a PM_2.5. Además, en una cohorte de 11.712 pacientes con cáncer de pulmón, se observaron trastornos significativos del metabolismo de los lípidos en niveles más altos de PM._2.5 áreas contaminadas. En vista de eso, dSe descubrió que el limoneno inhibe los cambios en el metabolismo de los lípidos mediante la regulación positiva de la expresión de miR-195, que inhibe la expresión de genes lipogénicos (SREBF1/FASN/ACACA) específicamente. Y un pequeño ensayo de intervención en humanos mostró que el miR-195 sérico aumentó después de la ingesta oral de d-limoneno.

Conclusión

Nuestros hallazgos revelan un nuevo mecanismo de fibrosis pulmonar y LUAD que está relacionado con PM_2.5 acumulación de gotas de lípidos inducida por la exposición. También demostramos que d-El eje limoneno-miR-195-SREBP1/FASN es una posible intervención preventiva para mediar en la progresión y el desarrollo de LUAD inducido por PM_2.5 exposición.

Registro de prueba Registro de ensayos clínicos chinos, ChiCTR2000030200. Registrado el 25 de febrero de 2020, http://www.chictr.org.cn/showproj.aspx?proj=48013

Gráficamente abstracto

El cáncer de pulmón es el segundo tumor maligno más común después del cáncer de mama y la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. Debido a la reducción del tabaquismo, la incidencia de carcinoma de células escamosas de pulmón (LUSC) ha disminuido, mientras que la incidencia de adenocarcinoma de pulmón (LUAD) ha aumentado en los no fumadores [2]. Además del tabaquismo, los datos epidemiológicos muestran que la contaminación del aire ambiente exterior, especialmente las partículas finas (PM_2.5) la contaminación, es otro factor de riesgo para el cáncer de pulmón y ha sido clasificado como carcinógeno de nivel I por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer [3]. Debido al pequeño tamaño de las partículas (diámetro equivalente aerodinámico ≤ 2,5 μm) y a la gran área de superficie en una concentración dada, PM_2.5 puede invadir fácilmente la circulación alveolar y sanguínea humana y transportar una variedad de materiales peligrosos, como carcinógenos, que promueven la aparición de enfermedades. Un metanálisis indicó que el riesgo de cáncer de pulmón aumentó un 9% cuando el PM_2.5 concentración aumentada en 10 µg/m³ [4]. Basado en un estudio prospectivo en el biobanco del Reino Unido, la exposición a largo plazo a PM_2.5 se asoció con una función pulmonar más baja y una mayor prevalencia de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), y puede aumentar el riesgo de cáncer de pulmón, especialmente en aquellos con alto riesgo genético [5, 6]. El estudio sobre una cohorte de chinos de 118 551 participantes también proporciona pruebas sólidas de que los altos niveles de PM_2.5 la exposición conduce a un riesgo elevado de incidencia y mortalidad por cáncer de pulmón [7]. Sin embargo, el mecanismo potencial de PM_2.5 lesión pulmonar inducida aún necesita mayor comprensión.

El estrés oxidativo, la respuesta inflamatoria, la autofagia y el daño mitocondrial han sido el foco de PM_2.5 lesión pulmonar inducida y enfermedad cardiovascular [8,9,10,11]. Recientemente, el análisis integrado de metabolómica y proteómica de células epiteliales bronquiales humanas expuestas a PM_2.5 revelan alteraciones significativas de muchos procesos metabólicos, como el metabolismo de los aminoácidos, el ciclo del ácido cítrico y el metabolismo de los lípidos [12]. La alternancia del metabolismo de los lípidos es otra característica destacada del cáncer además del metabolismo de los carbohidratos, y la síntesis o absorción mejorada de lípidos contribuye al rápido crecimiento de las células cancerosas y la formación de tumores [13, 14]. La mayoría de los estudios realizados sobre los efectos de PM_2.5 la exposición sobre el metabolismo de los lípidos se ha centrado en las enfermedades cardiovasculares y relacionadas con el hígado, especialmente en la aterosclerosis, la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), la fibrosis hepática y el carcinoma hepatocelular [15,16,17,18]. Sin embargo, los estudios sobre lesión pulmonar causada por PM_2.5 el trastorno del metabolismo de los lípidos inducido por la exposición son escasos.

En el presente estudio, integramos LUAD/células bronquiales humanas, modelos de ratones de tipo amplio/knock out y ensayos de intervención poblacional para estudiar exhaustivamente el mecanismo biológico potencial de PM_2.5 exposición sobre la aparición y progresión de LUAD a través de la vía del trastorno del metabolismo de los lípidos. Identificamos la síntesis de novo de la vía de los lípidos que desempeña un papel fundamental en la mediación de la lesión pulmonar inducida por PM_2.5 exposición. Y se observó una mayor formación de gotas de lípidos en células cancerosas y normales, respectivamente, a las que llamamos “pulmón graso”. También descubrimos que el D-limoneno podría inhibir la aparición y progresión de LUAD mediante la inhibición de la actividad de los genes lipogénicos. En conjunto, nuestro estudio revela un posible mecanismo de lesión pulmonar causada por PM_2.5 exposición y sugiere una nueva intervención preventiva de bajo costo para las personas que viven en PM_2.5 regiones contaminadas.

PM_2.5 recogida y preparación de muestras

El sitio de muestreo se ubicó en la Escuela de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghai en la ciudad de Shanghai, China. PM_2.5 se muestreó continuamente usando un muestreador de bajo volumen Echo PM cerca de la entrada de aire para las cámaras de exposición (MSP HFI-129, China). Cada 3 días se utilizó un filtro nuevo para el muestreo. Además, se utilizaron blancos de campo para controlar la posible contaminación durante los procedimientos de muestreo. Después del muestreo, los filtros se cortaron en pedazos diminutos y se colocaron en un ultrasonicador durante 2 horas. Después de la filtración, PM_2.5 solución se purificó en un liofilizador al vacío durante 7 días, y PM_2.5 el polvo se almacenó en un ultracongelador de almacenamiento en frío. Se utilizaron espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS), espectrómetro de masas de cromatografía de gases (GC-MS) y analizador de carbono para analizar las composiciones de PM_2.5 polvo.

Cultivo celular y tratamientos.

Las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano (A549, NCL-H1975) y la línea celular epitelial bronquial humana inmortalizada (Beas-2b) se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células se mantuvieron en DMEM/medio alto en glucosa suplementado con 10 % de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina a 37 °C en un 5 % de CO₂ incubadora de cultivo humidificado. Según nuestros estudios previos [19, 20]las células fueron expuestas a PM_2.5 o d-limoneno durante 48 h a una concentración final de 100 µg/mL o 0,25 mmol/L por separado. Las células Beas-2b se trataron con la misma concentración y se mantuvieron durante 30 pases. A continuación, las células tratadas se analizaron en ensayos posteriores. Todos los experimentos se realizaron con células libres de micoplasma.

transfección de ARNsi

Se utilizaron ARNsi específicos (Jima Gene, China) para la eliminación de SREBF1 y FASN. Las células A549 y H1975 se sembraron en una placa de 6 pocillos y se transfectaron con 1 µM SREBF1 o FASN siRNA a través de Lipofectamine 2000. Después de la transfección de siRNA durante 24 h, las células se estimularon con 100 µg/ml de PM_2.5 por…