El disulfiram atenúa la hipertensión pulmonar inducida por hipoxia al inhibir la escisión y la piroptosis de GSDMD en HPASMC

Antecedentes

La hipertensión pulmonar (HP) se caracteriza por un remodelado arterial pulmonar progresivo, asociado con diferentes grados de inflamación y procesos inmunes alterados. El disulfiram elimina la formación de poros de la membrana plasmática de N-gasdermina D (GSDMD) para prevenir la piroptosis. La piroptosis es una forma de muerte celular lítica caracterizada por la activación del inflamasoma y la liberación de citocinas proinflamatorias que actúan en el desarrollo de la HP. Intentamos investigar si el disulfiram podría aliviar el PH inducido por la hipoxia al inhibir la piroptosis.

Métodos

Para investigar si el disulfiram alivia la progresión de la hipertensión pulmonar, se expuso a los roedores a hipoxia crónica (10 % de oxígeno, 4 semanas) para inducir la HP. La gravedad de la HP se evaluó midiendo la presión sistólica del ventrículo derecho, la presión arterial pulmonar media y el grado de hipertrofia del ventrículo derecho. Se usó transferencia Western para medir las proteínas asociadas con la vía de la piroptosis y se realizó ELISA para medir la secreción de IL-18 e IL-1β, los cuales son los métodos principales para evaluar la piroptosis.

Resultados

Las concentraciones de IL-18 e IL-1β fueron mayores en los pacientes con HP que en los controles normales. El disulfiram suprimió la progresión de la HP en ratones y ratas a través del alivio de la remodelación arterial pulmonar. Las proteínas relacionadas con la piroptosis y el inflamasoma se activaron en modelos de HP en roedores. El disulfiram inhibió el procesamiento de GSDMD en N-GSDMD y atenuó la secreción de IL-1β e IL18. Los experimentos in vivo mostraron que el disulfiram también inhibía la muerte lítica en las HPASMC.

Conclusiones

El tratamiento con disulfiram reduce la progresión de la PH mediante la supresión de la remodelación vascular al inhibir la escisión y la piroptosis de GSDMD. Podría convertirse en una nueva opción terapéutica para el tratamiento de la HP.

La hipertensión pulmonar (HP) es una clase de trastornos hemodinámicos caracterizados por una remodelación arterial pulmonar progresiva, vasoconstricción y trombosis asociada con diferentes grados de inflamación y procesos inmunitarios alterados, que finalmente conducen a insuficiencia cardíaca derecha y muerte. [1]. La hipertrofia y la proliferación de las células del músculo liso de la arteria pulmonar humana (HPASMC, por sus siglas en inglés) se consideran cambios fisiopatológicos importantes de la remodelación de la arteria pulmonar en la HP [2]. Aunque la activación del inflamasoma en los vasos pulmonares se ha considerado un factor crítico para la remodelación arterial pulmonar [3]no existen dianas terapéuticas específicas.

La piroptosis es una forma de muerte celular inflamatoria diferente a la apoptosis, necrosis, ferroptosis y muerte celular autofágica, caracterizada por la activación del inflamasoma y la familia de las caspasas y la liberación de numerosas citocinas proinflamatorias [4]. La piroptosis se clasifica ampliamente en piroptosis celular clásica dependiente de caspasa-1 y piroptosis celular no clásica dependiente de caspasa-4/5/11. Los complejos de inflamasomas, la caspasa 1, la familia de la gasdermina, la interleucina-18 (IL-18) y la IL-1β son componentes fundamentales de la piroptosis dependiente de caspasa-1 [5]. Los inflamasomas activados, a través de componentes como los dominios de unión a nucleótidos y los receptores repetidos ricos en leucina, reclutan una proteína similar a una mota asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasa (ASC) para ensamblarse en complejos de inflamasomas para activar la caspasa-1 [6]. Entre los diversos complejos de inflamasomas, el complejo proteína 3 similar al dominio de oligomerización de unión a nucleótidos (NLRP3)/ASC es el mejor caracterizado. [7]. El complejo NLRP3/ASC activa la caspasa-1 al CI. El fragmento de caspasa-1 provoca la escisión de la gasdermina D (GSDMD), pro-IL-18 y pro-IL-1β, lo que conduce a la formación de poros en la membrana celular y la liberación de IL-1β e IL-18 [8]. La piroptosis está involucrada en el desarrollo y progresión de la HP. La piroptosis HPASMC contribuye a la HP [9,10,11]. La inhibición de la vía NLRP3 atenúa la insuficiencia cardíaca aguda inducida por LPS en ratas con PH inducida por monocrotalina [12]. La ausencia de ASC tiene un efecto protector en la PH hipóxica [13, 14]. La eliminación de la caspasa-1 atenúa las características patogénicas de la HP, como la remodelación arterial pulmonar, la disfunción del corazón derecho y la fibrosis vascular pulmonar [15]. IL-1β e IL-18 también impulsan la resistencia a la apoptosis y la proliferación excesiva de HPASMC a través de varios mecanismos diferentes [15,16,17,18]. Estos resultados indican que la piroptosis juega un papel importante en la aparición y progresión de la HP.

Recientemente se ha demostrado que el disulfiram (DSF), un fármaco aprobado por la FDA para la adicción al alcohol, bloquea la piroptosis y la liberación de citoquinas en las células al inhibir la unión de N-GSDMD a los fosfolípidos ácidos en la capa interna de la membrana plasmática celular. [19]. Aunque los tratamientos existentes para la HP han mejorado significativamente los resultados de los pacientes con HP [20], muchos pacientes no cumplen con las expectativas. En este estudio, investigamos si DSF podría aliviar la presión sistólica del ventrículo derecho (RVSP), la hipertrofia del ventrículo derecho (RVH) y la remodelación vascular en modelos de roedores de HP inducida por hipoxia al inhibir la piroptosis de HPASMC, proporcionando una nueva opción terapéutica para el tratamiento. de PH.

Mediciones de IL-1β e IL-18 en plasma en pacientes con HP

Las muestras de sangre utilizadas en este estudio se obtuvieron de pacientes hospitalizados que se sometieron a un cateterismo del corazón derecho en el Sexto Hospital de Wuhan entre 2020 y 2022 (archivo adicional 1: Tabla S1). Catorce pacientes con HP idiopática, hereditaria, asociada a enfermedad pulmonar y asociada al corazón izquierdo y 16 pacientes sin HP fueron seleccionados para este estudio. La presión de la arteria pulmonar se midió en todos los pacientes mediante cateterismo cardíaco derecho. El criterio diagnóstico de HP fue una presión arterial pulmonar media en reposo (mPAP) ≥ 25 mmHg medida por catéter cardíaco derecho [2].

Cultivo de células

Las HPASMC se obtuvieron de iCell Bioscience (Shanghai, China). Las células se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Keygen, China) complementado con suero bovino fetal al 10 % (ProCell, China) y suplemento de crecimiento de células de músculo liso (n.º 1052, ScienCell) a 37 °C en un 5 % de CO₂ incubadora. La hipoxia fue inducida por el crecimiento en una incubadora hipóxica al 2% de O₂.

animales y tratamientos

En este estudio se seleccionaron animales machos para evitar los efectos hormonales. Los animales se marcaron con un código numérico para asegurar que fueran asignados aleatoriamente a un grupo diferente, de la siguiente manera: (a) normoxia durante 28 días seguida de vehículo (aceite de maíz), (b) normoxia durante 28 días seguida de DSF (HY- B0240, MCE, Shanghái, China), (c) hipoxia durante 28 días seguida de vehículo (aceite de maíz) y (d) hipoxia durante 28 días seguida de DSF. En el grupo de hipoxia, los ratones C57 macho y las ratas Sprague-Dawley fueron expuestos continuamente a hipoxia (10% O₂) en cámara hipóxica normobárica durante 4 semanas. El ambiente hipóxico se logró mediante la suplementación con nitrógeno al 100 % y se verificó con un medidor de oxígeno (CY-12C, Hangzhou, China) para detectar la concentración de oxígeno. El grupo de normoxia estaba en la misma habitación pero con 21% de O₂. Luego, cada grupo de control recibió vehículo (aceite de maíz) y cada grupo de DSF recibió DSF mediante administración intragástrica a una dosis de 50 mg/kg/día después de 28 días de hipoxia.

Análisis hemodinámico y medición del peso ventricular

Después de anestesiar a los ratones, se intubaron y ventilaron con un ventilador para animales pequeños (DW3000-B, Huaibei Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., Anhui, China) con un volumen tidal de 1 ml y una frecuencia respiratoria de 100 respiraciones. /min utilizando el aire de la habitación. RVSP procedió inmediatamente después de abrir el cofre. En concreto, se insertó cuidadosamente una aguja de 0,45 mm de diámetro y 16 mm de longitud en el vértice del ventrículo derecho.

Después de anestesiar a las ratas, se expuso la vena yugular derecha y se insertó un catéter curvo PE-50 en la vena yugular derecha para registrar la presión arterial pulmonar media (mPAP). Todos los animales fueron anestesiados por vía intraperitoneal…