El gen FoxP1 regula la función pulmonar, la producción de metaloproteinasas de matriz y mediadores inflamatorios, y la viabilidad del epitelio pulmonar

Fondo

Los genes involucrados en el desarrollo de los pulmones pueden desregularse en la vida adulta y contribuir a la patogenia de las enfermedades pulmonares. Múltiples genes regulan el desarrollo pulmonar, incluida la proteína de caja Forkhead P1-4 (FoxP1-4).

Métodos

Examinamos la asociación entre las variantes en los genes FoxP1-4 y la función pulmonar utilizando datos de un GWAS que incluía cerca de 400 000 personas y 20 millones de SNP.

Resultados

Más de 100 variantes en el gen FoxP1, pero ninguna en los genes FoxP2-4, están asociadas con la función pulmonar. La variante centinela en el gen FoxP1 asociado con FEV1 fue rs1499894 (C > T), mientras que la variante centinela en el gen FoxP1 asociado con FVC fue rs35480566 (A > G). Aquellos con el alelo T en lugar del alelo C para rs1499894, o el alelo G en lugar del alelo A para rs35480566 habían aumentado los niveles de ARNm de FoxP1 en los datos transcriptómicos, FEV1 y FVC más altos, y menos probabilidades de ser diagnosticados con fibrosis pulmonar idiopática. Además, la eliminación de FoxP1 en las células epiteliales pulmonares por la interferencia del ARN condujo a un aumento de los niveles de ARNm para las metaloproteinasas de matriz 1, 2, 3 y las citocinas proinflamatorias IL-6 e IL-8, así como a una reducción de la viabilidad celular después de la exposición al humo del cigarrillo. todos los procesos implicados en la patogenia de la EPOC y la FPI.

Conclusiones

Nuestros resultados sugieren que la proteína codificada por el gen FoxP1 puede proteger contra el desarrollo de la EPOC y la FPI. Un papel causal de FoxP1 en la patogénesis de la EPOC y la FPI puede justificar una mayor investigación, y FoxP1 puede ser un nuevo objetivo terapéutico para estos trastornos pulmonares.

Los pulmones poco desarrollados son un factor de riesgo aceptado para la EPOC. Sin embargo, no se aprecia tan bien que los genes del desarrollo puedan volverse disfuncionales en la vida adulta y contribuir a la EPOC, así como a otras enfermedades pulmonares como la FPI. [1, 2]. Varios genes son fundamentales para el desarrollo adecuado de los pulmones, incluidos los 4 miembros de la subfamilia P de los factores de transcripción de la caja Forkhead (FoxP1-4) [3, 4]. Sin embargo, la relación entre las variantes en los genes FoxP y la función pulmonar en adultos no se ha examinado completamente.

Las variantes asociadas con una función pulmonar deficiente también están asociadas con el desarrollo de EPOC y FPI. Por ejemplo, las variantes en el locus FAM13A se han asociado con espirometría alterada y EPOC. [5]. Del mismo modo, existe una susceptibilidad genética compartida entre el deterioro de la función pulmonar y la FPI [6]. Específicamente, las variantes en el locus DSP se han asociado no solo con una CVF reducida y un FEV1/FVC aumentado, sino también con un diagnóstico de FPI [7].

Examinamos la asociación entre las variantes en los genes FoxP1-4 y la función pulmonar utilizando datos del estudio de asociación de todo el genoma realizado en las cohortes del Reino Unido BioBank y SpiroMeta. Además, investigamos si las variantes centinela en estos genes estaban asociadas con un diagnóstico de fibrosis pulmonar o con cambios en la expresión génica utilizando conjuntos de datos transcriptómicos. Finalmente, utilizamos células epiteliales de pulmón para estudiar el impacto de la eliminación del gen en la secreción de metaloproteinasas de matriz y citoquinas inflamatorias, así como la viabilidad celular.

Presumimos que múltiples variantes en los genes FoxP estarían asociadas con una función pulmonar alterada, expresión génica y que la eliminación afectaría la producción de metaloproteinasas de matriz y citocinas inflamatorias, así como la viabilidad del epitelio pulmonar.

GWAS para la función pulmonar

Se analizaron los datos de GWAS realizados utilizando datos combinados del biobanco del Reino Unido y el Consorcio SpiroMeta. Los detalles de este GWAS han sido descritos previamente por otros [8]. En resumen, las personas se incluyeron en el análisis de la cohorte del Biobanco del Reino Unido si (1) tenían datos completos de edad, sexo, altura y tabaquismo; (2) tenían una espirometría que cumplía con los requisitos de control de calidad; (3) tenían datos imputados de todo el genoma y (4) eran de ascendencia europea. La ascendencia europea se determinó en base a la agrupación de medios K utilizando los primeros 2 de los 10 componentes principales proporcionados en los datos genéticos del Biobanco del Reino Unido. Se identificaron 6 grupos, incluido uno de ascendencia europea. El genotipado se llevó a cabo utilizando las matrices Affymetrix Axiom UK BiLEVE y UK Biobank. En total, se incluyeron 321.047 personas del BioBank del Reino Unido. Residuales de la regresión lineal de cada rasgo (FEV1, FVC y FEV1/FVC) contra la edad, la edad², el sexo, la altura, el estado de fumador (alguna vez o nunca) y la matriz de genotipificación se clasificaron y se transformaron inversamente a normal, dando puntuaciones Z distribuidas normalmente. Estos puntajes Z se usaron para GWAS a través de un modelo genético aditivo usando BOLT-LMM v2.3.

El consorcio SpiroMeta estaba compuesto por 79 055 personas de 22 estudios [8]. En cada estudio, se ajustaron modelos de regresión lineal para cada rasgo (FEV1, FEV1/FVC y FVC), con ajuste por edad, edad²sexo y altura.

Se metanalizaron un total de 19 819 130 variantes (imputadas o genotipadas) tanto en UK Biobank como en SpiroMeta, utilizando un metanálisis de efectos fijos ponderado de varianza inversa como se describió anteriormente. [8]. La variante centinela se definió como la variante en una señal de asociación (pags< 5 × 10⁻⁹) donde ninguna otra variante dentro de 1 Mb mostró una asociación más fuerte. Para el análisis condicional, se extrajeron los SNP ± 1 Mb de las variantes centinela y se usaron para el análisis condicional paso a paso para seleccionar SNP asociados de forma independiente dentro de cada región de 2 Mb, usando GCTA. Los resultados se resumieron como gráficos de Manhattan y gráficos de asociación regional.

El desequilibrio de ligamiento se evaluó usando LDlink y se reporta como el r² [9].

GWAS para FPI

Las señales genéticas del deterioro de la función pulmonar a menudo se superponen con las de los trastornos pulmonares fibróticos, el más común de los cuales es la fibrosis pulmonar idiopática (FPI). Por lo tanto, después de identificar los SNP centinela asociados con la función pulmonar, determinamos si estas variantes también se asociaron con un diagnóstico de FPI. Hicimos esto usando datos GWAS publicados previamente que combinaron datos de 3 estudios (n = 2668 casos y 8591 controles con 10 790 934 variantes bien imputadas) [7].

análisis eQTL

La mayoría de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) se encuentran en regiones no codificantes/intrónicas y, por lo tanto, no alteran la secuencia de las proteínas codificadas. Aunque estos SNP se encuentran en regiones intrónicas, pueden ejercer efectos biológicamente significativos al regular la expresión de genes cercanos. Dichos SNP se denominan eQTL o loci de rasgos cuantitativos de expresión.

Determinamos si los SNP centinelas en los genes FoxP eran eQTL utilizando los conjuntos de datos GTex y QTLbase [10]. Los resultados se resumen como gráficos de violín.

Cultivo celular y ARN de interferencia

Las células BEAS-2B se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron en Hite’s Medium (DMEM F12 con suero bovino fetal al 10 %, L-glutamina 2 mM, 1 × aminoácidos no esenciales, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM , y 1 × Penicilina/Estreptomicina) en placas de 10 cm. Las células se transfectaron con ARN de interferencia pequeño de sustrato dicer 50 nM (ARN dsi, Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa) usando el reactivo de transfección GenMute (Signagen, Frederick, MD) una vez con una confluencia del 60 al 70%.

El ARN se aisló de las células usando RNeasy Mini Kits (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El ARN aislado se convirtió inmediatamente en ADNc usando kits de ARN a ADNc de alta capacidad (Life Technologies, Grand Island, NY) después de medir sus concentraciones. Los ensayos de PCR en tiempo real se realizaron utilizando SYBR® Select Master Mix para CFX (2X) (Life Technologies, Grand Island, NY) con el termociclador C1000 (BioRad, Hercules, CA) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores se enumeran en los materiales complementarios.

inmunotransferencia

Se descartaron los sobrenadantes y las células se lavaron dos veces con PBS enfriado con hielo. Se añadió tampón de lisis (0,5 % Triton en PBS con cóctel de inhibidor de proteasa 1 × Halt) y el lisado se raspó mecánicamente del fondo de cada pocillo. Los lisados ​​se sonicaron durante 15 s en hielo, se midió la concentración de proteínas (ensayo de proteínas DC, Bio-Rad) y se cargaron 20 μg/carril de lisado…