Renming Li,1,* Xiaomin Zhao,1,* pengcheng liu,1 dandan wang,1 Chen Chen,1 yu wang,1 ningning zhang,1 Bing Shen,2 Dahai Zhao1
1Departamento de Medicina Respiratoria y de Cuidados Críticos, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, Hefei, 230601, República Popular China; 2Facultad de Ciencias Médicas Básicas, Universidad Médica de Anhui, Hefei, 230032, República Popular China
*Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo
Correspondencia: Dahai Zhao, Department of Respiratory and Critical Care Medicine, the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University, 678 Furong Road, Hefei, 230601, People’s Republic of China, Tel +86-551-63869656, Email [email protected] Bing Shen, Escuela de Ciencias Médicas Básicas, Universidad Médica de Anhui, 81 Meishan Road, Hefei, 230032, República Popular de China, Tel +86-551-65161132, Fax +86-551-65161126, Correo electrónico [email protected]
Propósito: Como enfermedad respiratoria común, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) tiene una alta morbilidad y mortalidad. Las terapias clínicas actuales no son ideales y no mejoran la función pulmonar ni la calidad de vida a largo plazo. Es muy importante encontrar nuevos mecanismos patogénicos potenciales, biomarcadores y dianas con valor terapéutico en la EPOC.
Métodos: Las muestras de suero recolectadas de la exacerbación aguda y la EPOC estable y los participantes sanos se analizaron mediante espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida sin etiquetas para identificar las proteínas expresadas diferencialmente (DEP) entre dos grupos. Se realizaron análisis bioinformáticos para determinar los procesos biológicos asociados con esos DEP. Las proteínas clave se validaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Resultados: En total, se detectaron 661 proteínas en suero de pacientes con EPOC y participantes sanos. En comparación con los participantes sanos, los pacientes con exacerbación aguda de la EPOC tenían 45 DEP, 13 estaban regulados al alza y 32 estaban regulados a la baja; y los pacientes con EPOC estable tenían 79 DEP, 18 estaban regulados al alza y 61 estaban regulados a la baja. Los resultados de la anotación funcional de Gene Ontology indicaron que las DEP identificadas en pacientes con EPOC estaban asociadas con los términos entidad anatómica celular, unión y proceso celular. El análisis de anotaciones funcionales de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto y el análisis de la base de datos de Clusters of Orthologous Genes indicaron que las funciones de estos DEP eran principalmente en los mecanismos de transducción de señales y el transporte y metabolismo de aminoácidos. Los resultados de ELISA para tres proteínas clave de IGFBP2, LRG1 y TAGLN coincidieron con los resultados de LC-MS/MS y el área bajo la característica operativa del receptor del índice combinado fue de 0,893 (IC del 95 %: 0,813, 0,974).
Conclusión: Nuestros hallazgos sugirieron mecanismos patogénicos subyacentes a las etapas de la EPOC e indicaron tres proteínas clave que pueden justificar un mayor estudio como biomarcadores potenciales para el diagnóstico temprano o el pronóstico de la EPOC o como dianas terapéuticas.
Palabras clave: enfermedad pulmonar obstructiva crónica, respiración, proteómica, proteínas expresadas diferencialmente, bioinformática, LC-MC/MS
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad común, prevenible y tratable. La caracterización de la EPOC incluye síntomas respiratorios persistentes y limitación del flujo de aire debido a anomalías alveolares o de las vías respiratorias causadas típicamente por una exposición significativa a partículas o gases nocivos.1 Está bien documentado que la EPOC es una enfermedad heterogénea y multifacética afectada por factores genéticos y ambientales.2 La Organización Mundial de la Salud informa que para 2030, la EPOC ocupará el tercer lugar entre las enfermedades crónicas que causan morbilidad y muerte.3 Los estudios también predicen que cada año, 4,5 millones de personas morirán de EPOC y sus enfermedades relacionadas para 2030, y más de 5,4 millones para 2060.4 China Pulmonary Health analizó datos de 50 991 personas, incluidos 21 446 hombres y 29 545 mujeres, para determinar que la prevalencia de la EPOC definida por espirometría es del 8,6 %. El informe señaló además que hay aproximadamente 99,9 millones de personas con EPOC en China, de las cuales la tasa de prevalencia entre los hombres es del 11,9 % y entre las mujeres es del 5,4 %. La tasa de prevalencia entre las personas de 40 años o más es mayor que la de las personas de 20 a 39 años.5,6 La EPOC tiene una alta incidencia, tasa de discapacidad y tasa de mortalidad en todo el mundo. Por lo tanto, son urgentes los estudios que conduzcan a una mayor prevención y tratamiento de la EPOC.
Dados los mayores riesgos y gastos asociados con las terapias quirúrgicas, pocos pacientes eligen este tratamiento. Así, en la actualidad, el tratamiento de la EPOC se basa principalmente en terapias de medicina interna. Las tres clases de agentes terapéuticos clínicos utilizados actualmente para tratar las exacerbaciones de la EPOC son los broncodilatadores, los antibióticos y los corticosteroides.7–9 La EPOC es una enfermedad recurrente que requiere un control farmacológico a largo plazo, lo que puede provocar resistencia a los medicamentos y efectos adversos, como inmunosupresión, osteoporosis, glaucoma y cataratas. Aunque esos agentes dilatan los bronquios, mejoran los síntomas y reducen el deterioro, no se dirigen a las causas específicas que inducen la EPOC. Además, ningún estudio ha demostrado que estos medicamentos mejoren la función pulmonar de los pacientes, el cumplimiento de la medicación y la calidad de vida a largo plazo. Por lo tanto, se necesita el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento etiológico en lugar del tratamiento sintomático de la EPOC.10,11
Con el desarrollo relativamente reciente de la proteómica que utiliza espectrometría de masas (MS) de alta sensibilidad, la sensibilidad, la precisión y la velocidad de la tecnología de perfilado de proteínas han mejorado mucho, lo que ayuda al estudio de la EPOC.12 Por ejemplo, Nicholas et al recogieron muestras de esputo de 15 pacientes con EPOC y 18 fumadores sanos, y utilizaron electroforesis en gel bidimensional y técnicas de identificación espectrométrica de masas para identificar 40 DEP entre los dos grupos.13 Dichos estudios que analizan la proteómica y los perfiles de péptidos en muestras de suero obtenidas de pacientes con EPOC pueden identificar biomarcadores relacionados con la aparición y el desarrollo de la enfermedad. La espectrometría de masas en tándem con cromatografía líquida (LC-MS/MS) es un poderoso método de proteómica que puede identificar muchas proteínas expresadas diferencialmente (DEP) con alta sensibilidad y especificidad. Podemos encontrar efectivamente proteínas clave relacionadas con la aparición y el desarrollo de la EPOC a través del experimento LC-MS/MS. Por lo tanto, el presente estudio utilizó esta estrategia. Recolectamos muestras de suero de participantes de control sanos, pacientes con exacerbación aguda de la EPOC y pacientes con EPOC estable, y utilizamos métodos de LC-MS/MS sin etiquetas para identificar los DEP. Además, empleamos métodos bioinformáticos para analizar las vías de señalización asociadas con los DEP y determinar si alguno de ellos puede estar asociado con el desarrollo de una exacerbación aguda o una EPOC estable.
Materiales y métodos
Información Clínica y Recogida de Muestras
De agosto a septiembre de 2021, entre los pacientes ingresados en el Departamento de Medicina Respiratoria y de Cuidados Críticos, el Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, se recolectaron 11 muestras de suero para experimentos de LC-MC/MS. De ellos, se recogieron ocho muestras de suero de pacientes con EPOC, de los cuales cinco pacientes se encontraban en etapa de exacerbación aguda y tres pacientes en etapa estable, y las tres muestras restantes procedían de voluntarios sanos de control. Todos los diagnósticos clínicos siguieron las pautas de la Iniciativa Global para la Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica en 2021.
La investigación cumplió con la Declaración de Helsinki. Antes del experimento, la propuesta de investigación se presentó al Comité de Ética de Investigación Médica del Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, que aprobó el estudio (Número de Aprobación de Ética Médica de Anhui: YX2021-103). El consentimiento informado de cada paciente se obtuvo por escrito antes del estudio.
Extracción, cuantificación y control de calidad de proteínas
Utilizamos columnas de centrifugación de agotamiento de proteínas abundantes Pierce Top 12 (Cat. No. 85165, Thermo) para extraer proteínas. Para determinar la concentración de las proteínas extraídas, utilizamos el método de Bradford. Todas las muestras de suero se sometieron a electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) para determinar la cantidad total de proteína no degradada, y se usó tinción con plata para detectar las proteínas en el gel de poliacrilamida.
Hidrólisis enzimática de proteínas por tripsina
Combinamos 60 μg de la proteína cuantificada con 5 μL de solución de ditiotreitol (1 M) en un tubo de centrífuga. La mezcla se mantuvo a 37 °C durante 1 hora. Luego, se añadieron 20 μL de solución de yodoacetamida al tubo de centrífuga en la oscuridad, y la mezcla se dejó a temperatura ambiente durante otra hora. Después de centrifugar todas las muestras, descartamos el sobrenadante. El sedimento se mezcló con 100 µl de tampón de ácido úrico (urea 8 M, Tris-HCl 100 mM; pH 8,0). Después de tres episodios de centrifugación y la eliminación del sobrenadante cada vez, el precipitado resultante se mezcló con NH4HCO3 (50 mM, 100 µL). La mezcla se centrifugó tres veces más y cada vez se descartó el sobrenadante. Se añadió tripsina a un tubo de ultrafiltración en una proporción de 50:1 de proteína a tripsina. Las muestras se digirieron a 37 °C durante 12 a 16 h.
Análisis LC-MS/MS
Para identificar las DEP entre los grupos, se utilizó un sistema espectroscópico LC-MS/MS. Después de que la muestra marcada se mezclara con 40 µL de solución acuosa de ácido fórmico (0,1 %), los polipéptidos de la mezcla se separaron utilizando un sistema de fase líquida LC de alto rendimiento con caudal de nanolitros. La fase A de la fase móvil fue ácido fórmico al 0,1% en agua y la fase B fue ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo. Se utilizaron los siguientes parámetros de gradiente de fase B: 0-50 min, aumentado al 26%; 50-70 min, aumentó a 38%; 70–71 min, aumentado al 100%; y 71-78 min, permaneció al 100%. Los péptidos obtenidos se detectaron utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos (Cat. No. 85165, Thermo Scientific).
Búsqueda y análisis de la base de datos de secuencias
Los datos obtenidos a través de los análisis LC-MS/MS se evaluaron utilizando el software Proteome Discoverer, versión 2.4 (Thermo Fisher Scientific). La identificación de péptidos se realizó utilizando la base de datos proteómica humana que contiene secuencias UniProt.
Ontología génica (GO), Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) y grupos de grupos ortólogos (COG) de análisis de vías de señalización de proteínas
El recurso de ontología génica (http://www.geneontology.org/) es actualmente la base de datos más común utilizada para recuperar funciones genéticas y, en comparación con otras bases de datos, tiene el contenido más completo.14,15 La base de conocimientos de GO utiliza la definición de funciones genéticas (términos GO) para conectar estas clases y encontrar relaciones específicas.dieciséis La base de conocimientos de GO define y describe las funciones de los genes y las proteínas y, a menudo, se utiliza para aclarar las funciones que desempeñan los genes y las proteínas en las células. La base de conocimientos GO también incluye anotaciones GO, que se utilizan principalmente para vincular términos de la ontología con productos genéticos específicos. Para explorar la importancia del enriquecimiento de los DEP, llevamos a cabo un análisis de anotación funcional GO. Todos los DEP identificados se asignaron a sus respectivos términos GO, y luego se identificaron términos funcionales GO significativamente enriquecidos a través de análisis para determinar las funciones biológicas relacionadas significativas.
KEGG es un conjunto de bases de datos que contiene varias vías de señalización en procesos celulares y se utiliza principalmente para comprender las funciones biológicas avanzadas y la utilidad a nivel genómico y molecular.17 La base de datos de análisis en línea KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3) las funciones incluyen la anotación funcional de genes/proteínas y el enriquecimiento de genes funcionales. Esta base de datos se utilizó para determinar las rutas metabólicas bioquímicas y las rutas de transducción de señales asociadas con los DEP.
La base de datos COG está anotada con las funciones de las proteínas homólogas e incluye la base de datos KOG (agrupaciones de proteínas homólogas eucariotas) y la base de datos COG (agrupaciones de proteínas homólogas procariotas).18 El número de proteínas en los COG se obtuvo comparando la secuencia de…
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