Identificación de genes centrales relacionados con el epitelio de las vías respiratorias pequeñas en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica

by | Ene 19, 2023 | 0 comments

Lanlan Lin1,2 *, Guofu Lin1,2 & ast;, Xiaohui Chen,1,2 Hai Lin,1,2 Qinhuilin,1,2 yiming zeng,1– 3 Yuan Xu1– 3

1Departamento de Medicina Pulmonar y de Cuidados Críticos, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Fujian, Quanzhou, República Popular de China; 2Centro de Medicina Respiratoria de la Provincia de Fujian, Quanzhou, República Popular China; 3Centro de Investigación Clínica, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Fujian, Quanzhou, República Popular de China

*Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo

Correspondencia: Yuan Xu; Yiming Zeng, Departamento de Medicina Pulmonar y de Cuidados Críticos, Centro de Investigación Clínica, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Fujian; Centro de Medicina Respiratoria de la Provincia de Fujian, Quanzhou, República Popular China, Correo electrónico [email protected]; [email protected]

Fondo: Los epitelios de las vías respiratorias pequeñas pulmonares son el sitio principal de alteraciones celulares e histológicas en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), mientras que los genes centrales terapéuticos potenciales de los epitelios pulmonares rara vez se identifican para dilucidar alteraciones profundas en la progresión de la enfermedad.
Métodos: Se aplicó un conjunto de datos de micromatrices de GSE11906 que contenía epitelios de las vías respiratorias pequeñas de 34 no fumadores sanos y 33 pacientes con EPOC para detectar genes expresados ​​diferencialmente (DEG). El análisis de red de correlación de genes ponderados (WGCNA) se utilizó además para identificar los genes centrales relacionados con las características clínicas. Además, se aplicaron datos de secuenciación de ARN de una sola célula del conjunto de datos GSE173896 y GSE167295 para explorar la expresión y distribución de los genes centrales. Los niveles de expresión de genes hub en células epiteliales estimuladas por extracto de humo de cigarrillo (CSE) fueron detectados por RT-qPCR.
Resultados: Noventa y ocho DEG correlacionados con las características clínicas de la EPOC se identificaron a través de limma y WGCNA. Ocho genes hub (incluyendo AKR1C3, ALDH3A1, AKR1C1, CYP1A1, GPX2, CBR3, AKR1B1 y RSG) que podrían ejercer un papel antioxidante en el proceso de la EPOC. El análisis transcriptómico de una sola célula indicó que las expresiones de AKRAC3, ALDH3A1, GPX2, CBR3 y AKR1B1 aumentaron significativamente en el grupo con EPOC en comparación con el grupo normal. Además, encontramos que la expresión de ALDH3A1 fue el más abundantemente expresado en las células ciliadas. Los resultados de RT-qPCR indicaron que la mayoría de los nuevos genes candidatos se elevaron significativamente cuando las células epiteliales se expusieron a CSE.
Conclusión: A través de la integración de limma, WGCNA y el análisis de interacción proteína-proteína (PPI), se identificaron un total de ocho genes centrales candidatos del epitelio de las vías respiratorias pulmonares en la EPOC. Además, el análisis transcriptómico de una sola célula indicó que ALDH3A1 estaba enriquecido en células ciliadas, lo que puede proporcionar una nueva perspectiva sobre la patogenia y el tratamiento de la EPOC.

Palabras clave: EPOC, epitelio de las vías respiratorias pulmonares, genes centrales, humo de cigarrillo

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por obstrucción progresiva del flujo de aire, hipersecreción de moco e inflamación crónica de las vías respiratorias.1,2 representando la cuarta causa principal de muerte (126,000 muertes por año). La exposición a largo plazo al humo del cigarrillo puede inducir una respuesta inflamatoria del epitelio de las vías respiratorias y la destrucción de la pared alveolar en la EPOC.3

Los epitelios de las vías respiratorias pequeñas pulmonares son el sitio principal de alteraciones celulares e histológicas en la EPOC.4 que están revestidos principalmente por células epiteliales pseudoestratificadas que incluyen células club secretoras, células ciliadas y células basales.5,6 Se ha informado que las células epiteliales de las vías respiratorias expuestas al tabaco pueden inducir inflamación, estrés oxidativo y desequilibrio proteasa/antiproteasa.7 Evidencias emergentes han indicado que la inflamación y el desequilibrio de los sistemas de defensa antioxidantes fueron los principales factores predisponentes en la patogénesis de la EPOC y actuaron como objetivos excelentes para las terapias de la EPOC.8,9 Por lo tanto, es urgente identificar biomarcadores esenciales del epitelio pulmonar para dilucidar alteraciones profundas en la progresión de la enfermedad.

Estudios previos han informado una correlación entre la susceptibilidad a la EPOC y la expresión génica.10 Microarray de alto rendimiento y en silico el análisis puede proporcionar perfiles de expresión génica para identificar genes expresados ​​diferencialmente (DEG) asociados con pacientes con EPOC.11 Lin et al alguna vez han identificado biomarcadores genéticos candidatos en el proceso de la EPOC a través de en silico análisis.12 Aquí, aplicamos un análisis integrado del conjunto de datos GEO que contiene EPOC y sujetos de control mediante múltiples enfoques bioinformáticos para investigar los posibles biomarcadores y mecanismos moleculares para la EPOC.

En el estudio actual, los DEG se identificaron preliminarmente a través del paquete “limma” y WGCNA. Además, se construyeron la red de interacción proteína-proteína (PPI) y Cytoscape para identificar módulos de grupos relacionados con la EPOC. Las expresiones y distribuciones de los genes centrales asociados con el fenotipo clínico de la EPOC se identificaron mediante análisis unicelulares y se confirmaron in vitro. Nuestro estudio puede promover aún más la comprensión de los posibles mecanismos moleculares del epitelio pulmonar de las vías respiratorias pequeñas en la EPOC.

Materiales y métodos

Preparación del conjunto de datos

Los conjuntos de datos del perfil de expresión génica sin procesar se seleccionaron de Gene Expression Omnibus (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo). La búsqueda de conjuntos de datos se realizó utilizando las palabras clave “epitelio de las vías respiratorias o epitelio de las vías respiratorias”, “COPD”, “fumar”. Los criterios de selección fueron los siguientes: 1) Se incluyeron muestras de epitelio de vía aérea pulmonar de pacientes sanos no fumadores y con EPOC; 2) Todos los conjuntos de datos contenían información clínica de pacientes sanos y con EPOC, como edad, sexo, etnia, tabaquismo; 3) Los conjuntos de datos contenían al menos 30 casos normales y de EPOC. En base a los criterios anteriores, se obtuvieron los conjuntos de datos GSE11906 y GSE128708 (que contienen 84 muestras sanas de no fumadores y 124 de EPOC). La característica de los conjuntos de datos se presentó en Tabla S1. GSE11906 contenía epitelio de vías respiratorias pequeñas obtenido mediante broncoscopia de fibra óptica de 34 no fumadores sanos y 33 pacientes con EPOC. GSE11906 se utilizó para examinar DEG y WGCNA. GSE128708 se utilizó para la validación externa de los genes centrales. Además, se recopilaron datos de secuenciación de ARN unicelular de tres muestras de EPOC (GSE167295) y tres pulmones de donantes de control (GSE173896) para verificar la distribución, expresión y función potencial de los genes centrales en la EPOC.

Detección de DEG y análisis de enriquecimiento

El paquete R “limma” se utilizó para identificar DEG entre muestras sanas de no fumadores y muestras de epitelio de las vías respiratorias con EPOC. Genes con un ajustado PAG valor <0.05 y registro2 Se consideró que el cambio de pliegue > 2 se expresaba diferencialmente. El gráfico del volcán se generó para visualizar la distribución de los DEG identificados. El análisis de enriquecimiento de DEG fue ejecutado por KEGG y sobre la base de la colección de conjuntos de genes Hallmark en las bases de datos MsigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/).

WGCNA

Para identificar si los genes centrales estaban relacionados con las características clínicas de sujetos sanos y pacientes con EPOC, se realizó el conjunto de datos WGCNA de GSE11906 utilizando el paquete R.13 En primer lugar, se realizó el análisis de correlación de Pearson de todos los DEG para construir una matriz de adyacencia. Posteriormente, la matriz de adyacencia se transformó en una matriz de superposición topológica (TOM) cuando el poder de β = 7. Los genes con perfiles de expresión génica similares se colocaron en el mismo módulo. Se creó un dendograma de conglomerados basado en el TOM con un tamaño de conglomerado mínimo de 30.

Construcción de redes PPI y confirmación de genes centrales

Después de la selección de genes asociados con la respuesta a la clasificación GOLD basada en la conectividad del módulo, los genes se cargaron en la base de datos de la herramienta de búsqueda para la recuperación de genes interactivos (STRING) para estudiar las interacciones entre los DEG. Los datos de interacción de los genes mencionados anteriormente se descargaron de STRING y se analizaron con Cytoscape (versión 3.5.1) para construir una red PPI. Además, se utilizó el software CytoHubba para identificar los genes hub en los PPI y el análisis se realizó utilizando los parámetros predeterminados.14

Procesamiento y análisis de datos de scRNA-Seq

Se realizó un análisis unicelular para validar la expresión y distribución de los genes hub entre pacientes sanos y con EPOC. En los conjuntos de datos GSE167295 y GSE173896, se aplicó el paquete Seurat R v4.0 para realizar control de calidad, normalización, integración de muestras, corrección de lotes y agrupación de celdas. En combinación con la base de datos CellMarker, el paquete R único y la literatura relevante, se anotaron los grupos de células.15,dieciséis El análisis de genes expresados ​​​​diferencialmente y la abstracción de gráficos basada en partición (PAGA) se realizaron utilizando el paquete R y el software OmniAnalyzer.

Preparación de extracto de humo de cigarrillo

El extracto de humo de cigarrillo (CSE) se preparó de la siguiente manera: dos cigarrillos sin filtro (que contenían 0,8 mg de nicotina y 10 mg de alquitrán por cigarrillo, Shishi, China) se quemaron con una bomba de vacío. Se burbujeó humo lentamente a través de los 20 ml de medio sin suero para recolectar CSE. El medio se consideró como la solución 100% CSE. Posteriormente, el pH de CSE se ajustó a 7,4 y se filtró a través de un filtro de 0,22 μm (MilliporeSigma, Burlington, EE. UU.). Las soluciones de CSE se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Cultivo de células

La línea celular BEAS-2B se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, www.atcc.org). Las células se cultivaron en medio DMEM que contenía 10 % de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen, EE. UU.) y 1 % de penicilina-estreptomicina (Gibco, CA) a 37 °C en una atmósfera que contenía 5 % de CO2. No se necesita la aprobación ética de la aplicación de líneas celulares porque las líneas celulares están disponibles comercialmente.

Ensayo CCK-8

Se aplicaron ensayos CCK-8 para evaluar la viabilidad celular (Meilun Biotechnology, Dalian, China). Las células BEAS-2B se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 4,0 × 103 células/pocillo durante la noche y se trataron con diferentes concentraciones de CSE (0, 2,5 %, 5 %, 10 %, 20 %, 40 %) durante 24 h. Después de la incubación, se añadieron 100 µl de una mezcla de CCK-8 y medio sin suero en una proporción de volumen de 1:10 y se incubó durante 1 h más a 37 °C. La densidad óptica se midió a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Thermo Fisher Scientific). Tasa de inhibición celular (%) = [(Ac−As)/(Ac−Ab)] × 100; As=absorbancia del pocillo experimental, Ab=absorbancia del pocillo blanco y Ac=absorbancia del pocillo de control.

PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT‑qPCR)

El ARN se extrajo usando TRIzol® reactivo (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.) según el protocolo del fabricante. Después de confirmar la cuantificación y la pureza del ARN, el ARN extraído se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa (Takara). Luego, se realizó RT-qPCR en el sistema de PCR en tiempo real ABI 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) con un kit de PCR SYBR Green (Thermo Fisher Scientific, Inc.) de acuerdo con las siguientes secuencias de cebadores. Las secuencias de cebadores de genes correspondientes se enumeran en tabla 1. El nivel de expresión génica relativa se midió utilizando los 2−ΔΔCt método.

tabla 1 Información de secuencias de cebadores

Análisis estadístico

Se utilizó la prueba no paramétrica de suma de rangos de Wilcoxon para examinar la relación de las variables continuas entre los dos grupos. La diferencia estadística entre los grupos control y CSE se realizó con Student’s t-prueba. Se realizó el análisis de correlación de Pearson para identificar la correlación entre las dos variables. Todos los análisis se realizaron en el paquete de software R (versión 4.1.1). La significación estadística se definió cuando el PAG valor fue inferior a 0,05.

Resultados

Identificación de DEG en GSE11906

El diseño general del estudio se presentó en Figura 1. El conjunto de datos de microarrays se obtuvo de la base de datos GEO para analizar los DEG de las muestras de epitelio de la EPOC con un umbral de PAG <0.05 y cambio de veces log2 >2. Como se muestra en el gráfico del volcán, se identificaron 1130 DEG (1099 regulados al alza y 31 regulados a la baja) en el conjunto de datos GSE11906 (Figura 2A). El mapa de calor de los 20 principales DEG regulados al alza y a la baja se mostró en Figura 2B. El análisis GO indicó que los DEG eran…

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