Influencia del entorno sistémico de la EPOC en la función miogénica de las células precursoras musculares in vitro

Fondo:

La pérdida de masa y función muscular son manifestaciones sistémicas bien reconocidas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Las exacerbaciones agudas, a su vez, contribuyen significativamente a mejorar estas comorbilidades sistémicas. La participación de los precursores miogénicos en el mantenimiento y la recuperación de la masa muscular es poco conocida. El objetivo del presente estudio fue investigar los efectos del entorno sistémico vascular de pacientes con EPOC exacerbada y estable sobre el comportamiento miogénico de las células precursoras musculares humanas (MPC) in vitro.

Métodos:

Se utilizó suero de controles sanos y de pacientes con EPOC exacerbada y estable (antes y después del tratamiento con metilprednisolona) para estimular cultivos de MPC humanos. El análisis de proliferación se evaluó mediante ensayos de incorporación de BrdU. La diferenciación de MPC se examinó mediante RT-PCR en tiempo real, western blot y análisis de inmunofluorescencia.

Resultados:

La estimulación de MPC con suero obtenido de pacientes con EPOC estable no afectó la función de las células precursoras miogénicas. El entorno sistémico vascular durante una exacerbación aguda ejerció un efecto mitótico sobre las MPC sin alterar el resultado de la diferenciación miogénica. Sin embargo, después del tratamiento con metilprednisolona de pacientes con EPOC exacerbada aguda, el efecto mitótico se amplificó aún más, pero fue seguido por una capacidad de diferenciación deficiente. Además, estos efectos se evitaron cuando las células se cotrataron con el antagonista del receptor de glucocorticoides mifepristona.

Conclusión:

Nuestros hallazgos sugieren que la capacidad de MPC se conserva inherentemente en pacientes con EPOC, pero se ve comprometida después de la administración sistémica de MP. Este hallazgo refuerza el concepto de que el tratamiento con glucocorticoides a largo plazo puede afectar negativamente las decisiones sobre el destino de las células madre miogénicas e interferir con la recuperación de la masa muscular.

La pérdida de masa y función muscular, particularmente de los músculos de las extremidades inferiores, son manifestaciones sistémicas bien reconocidas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) [1]. Los mecanismos que subyacen a estos cambios tienen una base etiológica multifactorial [2,3,4,5,6] y tienen un impacto negativo en el pronóstico y la mortalidad [7,8,9]. Las exacerbaciones agudas, además de su impacto en la función pulmonar, promueven aún más el deterioro de la disfunción del músculo esquelético [10,11,12,13]. Los pacientes con EPOC que experimentan exacerbaciones agudas frecuentes tienen una atrofia muscular más severa junto con recuperaciones incompletas que dan como resultado una pérdida significativa de masa muscular y rendimiento en el tiempo. [10].

Los mecanismos que conducen a la atrofia muscular se han atribuido principalmente a un desequilibrio de los procesos anabólicos y catabólicos, lo que da como resultado la pérdida del contenido proteico. [14, 15]. Sin embargo, la atrofia muscular puede agravarse aún más por una recuperación deficiente de la masa muscular esquelética debido a un desequilibrio de la apoptosis y la regeneración y reparación celular. [15]. En consecuencia, se ha detectado un mayor número de núcleos apoptóticos en el músculo cuádriceps de pacientes con EPOC con peso normal y bajo peso. [16, 17]. Aunque el proceso de regeneración muscular parece ser un mecanismo plausible para regular la masa muscular [18]los estudios dirigidos a analizar su implicación en pacientes con EPOC de peso normal y bajo han recibido una atención limitada [15; 19, 20].

La reconstrucción del tejido muscular esquelético después del daño, el ejercicio repetido o como resultado de una enfermedad se ve facilitada por la acción de las células satélite (SC), una población de células precursoras miogénicas (MPC) ubicadas entre la lámina basal y el sarcolema de miofibras. [21]. En el músculo esquelético adulto, normalmente están inactivos, pero en respuesta a los estímulos ambientales se activan, proliferan extensamente, migran y se fusionan con las miofibras existentes para reparar el daño y/o facilitar un aumento de su tamaño. Esta progresión ordenada de eventos está controlada por factores de transcripción como Pax7 y factores reguladores musculares específicos, incluidos Myf5 y MyoD (expresados ​​en etapas tempranas), así como miogenina y Myf6 que regulan las etapas posteriores de la diferenciación miogénica. La formación de miotubos multinucleados que expresan proteínas estructurales musculares como las isoformas de miosina y la actina alfa reflejan una diferenciación y maduración completas de las células musculares esqueléticas contráctiles. [21]. Este proceso miogénico está modulado, a su vez, por diversos mediadores inflamatorios, como las citoquinas y las prostaglandinas. [22, 23].

La capacidad de las SC para soportar el mantenimiento de los tejidos depende de su abundancia y función. La función SC, a su vez, es el resultado de la interacción entre señales externas, que surgen de factores locales y sistémicos, y la capacidad inherente de las células para responder a esas señales y sufrir miogénesis. Por lo tanto, es probable que las alteraciones en el entorno sistémico vascular puedan influir en el comportamiento de las células satélite afectando su contribución a la homeostasis y reparación muscular. [24, 25].

En pacientes con EPOC estable y, particularmente durante los episodios de exacerbación, hay una profunda modificación del entorno sistémico que incluye niveles elevados de mediadores de estrés inflamatorio y oxidativo que pueden contribuir al deterioro muscular. [2, 3; 6; 26, 27]. Además, los marcadores inflamatorios sistémicos y las citoquinas como IL-6, IL-8, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), fibrinógeno, α1-antitripsina, mieloperoxidasa y proteína C reactiva (PCR) aumentan aún más durante los episodios de exacerbación. [28]. Además, las estrategias terapéuticas con glucocorticoides sistémicos, a pesar de los beneficios clínicos beneficiosos, no están exentas de riesgos [29]. Teniendo todo esto en cuenta, planteamos la hipótesis de que los factores circulantes presentes en el suero de la EPOC pueden afectar la capacidad miogénica de las MPC y dificultar su contribución a la recuperación de la masa muscular. Los objetivos del presente estudio fueron: (i) investigar los efectos del suero de pacientes con EPOC estable y exacerbada en la función del MPC humano in vitroy (ii) dilucidar los efectos del tratamiento con glucocorticoides (GC) durante las exacerbaciones agudas en este modelo celular.

Población de estudio

Un total de 12 sujetos participaron en el estudio como donantes de células precursoras musculares. especímenes musculares de vasto lateral se obtuvieron de 4 sujetos sanos, 4 pacientes con EPOC con peso conservado y 4 pacientes con EPOC con bajo peso (Tabla 1 A). La función pulmonar se evaluó mediante la determinación de valores espirométricos, volúmenes pulmonares estáticos y capacidad de difusión siguiendo procedimientos estándar. La EPOC fue diagnosticada de acuerdo con las guías actualmente disponibles [30, 31]. El estado nutricional se evaluó mediante diferentes indicadores como el Índice de Masa Corporal (IMC) y la determinación de la composición corporal por impedancia bioeléctrica (Índice de Masa Libre de Grasa, FFMI) [32]. Bajo peso se definió como IMC ≤ 20 y/o FFMI ≤ 16 kg/m².

Además, se inscribieron 21 sujetos para suministrar sus muestras de sangre con el fin de obtener los sueros necesarios para este estudio: 7 sujetos sanos, 7 pacientes con EPOC estable (SCOPD) y 7 pacientes con EPOC con exacerbación aguda (AEPOC) (Tabla 1B). Los pacientes con EPOC estable, definidos como pacientes sin ninguna exacerbación de la EPOC durante los 3 meses anteriores, fueron reclutados de una consulta externa del hospital. Se reclutaron pacientes con EPOC con una exacerbación aguda, definida como un empeoramiento sintomático respiratorio que motivó un cambio de medicación, al ingreso hospitalario.

El estudio se ajusta a los principios expuestos en la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de ética de nuestra institución (CEIC-IMAS; Ref. 2007/2961/I). Todos los participantes firmaron el consentimiento informado por escrito antes de la inscripción.

Cultivo de células precursoras de músculo

Se establecieron cultivos de células precursoras musculares (MPC) a partir de biopsias de vasto lateral como se describió previamente [32]. Después de eliminar la grasa y el tejido conectivo, la muestra de músculo se picó finamente con tijeras estériles, se digirió con colagenasa tipo I al 0,2 % (Sigma-Aldrich) durante 60 min y tripsina al 0,05 % (Gibco) durante 30 min a 37 °C con agitación ocasional. . Entonces las células eran…