La activación de neutrófilos y la NETosis son los impulsores predominantes de la inflamación de las vías respiratorias en un modelo murino inducido por OVA/CFA/LPS

Fondo

El asma es una de las enfermedades crónicas más comunes que afecta a más de 300 millones de personas en todo el mundo. Aunque la mayoría del asma se puede controlar bien, las personas con asma grave experimentan exacerbaciones recurrentes e imponen una carga económica sustancial al sistema de atención médica. La inflamación de los neutrófilos a menudo ocurre en pacientes con asma grave que tienen una respuesta deficiente a los glucocorticoides, lo que aumenta la dificultad del tratamiento clínico.

Métodos

Establecimos varios modelos de ratones con asma alérgica dominada por neutrófilos y analizamos la hiperreactividad de las vías respiratorias, la inflamación de las vías respiratorias y los cambios patológicos pulmonares. La formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) se analizó mediante microscopía confocal y transferencia Western.

Resultados

Descubrimos que el modelo de ratón inducido por ovoalbúmina (OVA)/adyuvante completo de Freund (CFA)/lipopolisacárido (LPS) en dosis baja recapituló mejor las alteraciones complejas en las vías respiratorias de pacientes humanos con asma grave. También observamos que los ratones expuestos a OVA/CFA/LPS producían grandes cantidades de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) en el tejido pulmonar y los neutrófilos de la médula ósea. Además, encontramos que reducir la producción de NET o aumentar la degradación de los NET puede reducir la inflamación de las vías respiratorias y la hiperreactividad de las vías respiratorias.

Conclusión

Nuestros hallazgos identifican un nuevo modelo de ratón de asma neutrofílica. También hemos identificado que los NET juegan un papel importante en los modelos de asma neutrofílica y contribuyen a la patogénesis del asma neutrofílica. Los NET pueden servir como un objetivo terapéutico prometedor para el asma neutrofílica.

El asma es una enfermedad respiratoria crónica heterogénea, caracterizada por hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR) e inflamación de las vías respiratorias. [1]. Hay cuatro fenotipos inflamatorios principales en el asma basados ​​en la proporción de granulocitos en el esputo inducido: asma neutrofílica, asma eosinofílica, asma paucigranulocítica y asma granulocítica mixta. [2]. El asma neutrofílica es uno de los principales tipos de asma grave [3], que presenta una peor función pulmonar, una inflamación más grave de las vías respiratorias y una peor respuesta al tratamiento. Por lo tanto, es crucial investigar la patogenia del asma neutrofílica.

Los modelos animales experimentales son esenciales para avanzar en la investigación fisiopatológica del asma, y ​​los ratones son los sujetos principales. Existen modelos animales clásicos de asma eosinofílica, como el modelo de asma sensibilizado con ovoalbúmina (OVA)/aluminio (Alum) y desafiado con OVA, el modelo de asma inducido por extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM), etc. [4,5,6,7]. Sin embargo, hasta donde sabemos, no existe un modelo animal de asma neutrofílico que sea universalmente aceptado. Actualmente, hay algunos estudios en animales de asma neutrofílica, por ejemplo, modelo de asma sensibilizado con OVA/adyuvante completo de Freund (CFA) y desafiado con OVA, modelo de asma sensibilizado con OVA/lipopolisacárido (LPS) y desafiado con OVA [8,9,10]. Si bien estos modelos recapitulan algunas de las características del asma neutrofílica humana, cada uno de estos modelos tenía ciertas limitaciones.

Los neutrófilos son las principales células efectoras de la inflamación y la infección tisular. [11]. La formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) es una función de los neutrófilos. [12]. Los neutrófilos aumentan cuando ocurre la inflamación, y pueden sufrir un proceso de NETosis, liberando NET fuera de las células [13]. Sin embargo, no se ha dilucidado por completo si los NET se generan y funcionan en el asma neutrofílica.

Nuestro estudio demostró que el modelo murino inducido por OVA/CFA/LPS es adecuado para el estudio como modelo de asma neutrofílica. Este tipo de modelo tiene inflamación neutrofílica masiva e hiperreactividad severa de las vías respiratorias. Además, también encontramos que se produjo una gran cantidad de NET y se correlacionó con la gravedad de la inflamación de las vías respiratorias. Por lo tanto, es razonable suponer que los NET desempeñan un papel funcional importante en el asma neutrofílica.

animales

Se adquirieron ratones BALB/c (hembra, 6-8 semanas) del Colegio Médico de Hangzhou (Hangzhou, China). Mantuvimos a todos los ratones en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) con un ciclo de 12 luz/12 oscuridad en el Experimental Animal Center, el First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University.

Sensibilización y desafío de alérgenos de ratón

Los modelos de ratón se indujeron utilizando protocolos modificados como se informó anteriormente [7,8,9]. Los ratones se agruparon al azar y se sensibilizaron el día 1 y el día 8. Para el grupo de asma OVA/Alum, se mezclaron 25 µg de OVA (A5503, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) disueltos en 100 µl de solución salina al 0,9 % 1: 1 con Imject Alum (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.) mediante inyección intraperitoneal (IP). Para el grupo de asma OVA/CFA, se mezclaron 25 µg de OVA disueltos en 100 µl de solución salina al 0,9 % 1:1 con CFA (F5881, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) por IP. inyección. Para el grupo de asma OVA/LPS, los ratones se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se les inyectó por vía intratraqueal usando una combinación de 25 µg de OVA con 0,1 o 10 µg de LPS (L2630, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en un volumen total de 40 µl, con solución salina al 0,9% como diluyente. Para el grupo OVA/CFA/0,1 LPS, el modelo de sensibilización es una combinación del grupo OVA/CFA y el grupo OVA/LPS. Después de la sensibilización, los grupos antes mencionados se expusieron a OVA al 1% en aerosol durante 30 min los días 15-17. Para el grupo OVA/CFA/0,1 LPS + DNasa I o el grupo OVA/CFA/0,1 LPS + CI-amidina, sobre la base del grupo OVA/CFA/0,1 LPS, inyección intravenosa de DNasa I (5 mg por kg de peso corporal). peso) o la inyección intraperitoneal de Cl-amidina (10 mg por kg de peso corporal) se realizó 1 h antes de cada desafío. Se usaron como controles ratones sensibilizados y desafiados con solución salina al 0,9%.

Medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias

La capacidad de respuesta de las vías respiratorias se evaluó 24 h después de la última provocación con OVA como se describió anteriormente [14]. Brevemente, los ratones se colocaron en una cámara de pletismógrafo (EMKA Technologies, París, Francia) durante al menos 10 minutos hasta la adaptación. Primero se determinaron los parámetros pulmonares de referencia y luego los ratones se expusieron secuencialmente a PBS en aerosol y metacolina (Mch, A2251, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) en concentraciones aumentadas (3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 mg/ml). en PBS). Pausa mejorada (Penh), una estimación indirecta de la resistencia de las vías respiratorias, se utilizó para medir la resistencia de las vías respiratorias a la metacolina. Después de cada nebulización, registre el valor de Penh durante 3 min y tome el promedio de tres valores consecutivos.

Lavado broncoalveolar

Los ratones se sacrificaron 48 h después de la última exposición a OVA, se recogieron suero, líquido de lavado broncoalveolar (BALF), médula ósea y tejido pulmonar para experimentos adicionales. Como se describió anteriormente [14], BALF se recogió en pulmones completos mediante la infusión de 1 ml de PBS a través de una cánula traqueal. Luego, el BALF se centrifugó y los sobrenadantes se almacenaron a -80 ° C hasta el análisis, el sedimento celular se resuspendió en PBS para el recuento diferencial de células o el análisis de citometría de flujo.

Análisis de citoquinas

La expresión de interleucina (IL)-4 (431 104), IL-17 A (432 504), IL-6 (431 304) e IL-1β (432 604) en BALF se cuantificó mediante el kit de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Biolegend , San Diego, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Tinción de histopatología de pulmón

Después de recolectar el BALF, se ligó el bronquio principal derecho y se perfundió el pulmón izquierdo y se fijó con paraformaldehído al 4% durante 24 h, seguido de embebido en parafina, seccionado, teñido con hematoxilina y eosina (H&E) o ácido de parafina-Schiff ( PAS) tinción. Las secciones se realizaron de forma ciega. El grado de inflamación en las secciones de pulmón teñidas con H&E se calificó como se describió anteriormente [15]: 0, normales; 1, pocas células inflamatorias; 2, un anillo de células inflamatorias de 1 capa de células de profundidad; 3, un anillo de células inflamatorias de 2 a 4 células de profundidad; 4, un anillo de células inflamatorias de más de 4 células de profundidad. Las células caliciformes que contienen moco en secciones de pulmón teñidas con PAS también se calificaron previamente descritas [16]: 0, sin PAS positivo…