La deficiencia de PKD1 induce bronquiectasias en un modelo porcino de ADPKD

by | Nov 6, 2022 | 0 comments

Resumen

Fondo

La poliquistosis renal autosómica dominante (PQRAD) es un trastorno genético prevalente, caracterizado principalmente por el desarrollo de quistes renales, así como diversas manifestaciones extrarrenales. Estudios previos han demostrado que la ADPKD está relacionada con las bronquiectasias, mientras que su mecanismo patogénico no está claro. En estudios previos, hemos generado la PKD1+/− cerdos para simular la progresión de la formación de quistes y alteraciones fisiológicas similares a las observadas en pacientes con ADPKD.

Métodos

Cambios fenotípicos en las células epiteliales de las vías respiratorias y las células mesenquimales en PKD1+/− los cerdos fueron evaluados por análisis histológico. Los mecanismos moleculares que impulsan estos procesos se investigaron utilizando PKD1+/− pulmones de cerdo, células mesenquimatosas humanas y generando PKD1 células epiteliales humanas deficientes.

Resultados

Identificamos bronquiectasias en PKD1+/− cerdos, lo que es consistente con los síntomas clínicos en pacientes con ADPKD. La deficiencia de PKD1 suprimió la expresión de E-cadherina en la barrera epitelial de las vías respiratorias, lo que agravó la invasión y condujo a una respuesta inflamatoria perpetuada. Durante este proceso, se alteraron los componentes de la matriz extracelular (ECM), lo que contribuyó al cambio del fenotipo de las células del músculo liso de las vías respiratorias de un fenotipo contráctil a un fenotipo proliferativo. Los efectos sobre las células del músculo liso dieron como resultado la remodelación de las vías respiratorias y el establecimiento de bronquiectasias.

Conclusión

Hasta donde sabemos, el PKD1+/− cerdo proporciona el primer modelo que recapitula la patogenia de las bronquiectasias en ADPKD. El rol de PKD1 en el epitelio de las vías respiratorias sugiere un objetivo potencial para el desarrollo de nuevas estrategias para el diagnóstico y tratamiento de las bronquiectasias.

Introducción

La bronquiectasia es una enfermedad crónica de inflamación pulmonar persistente e infecciones recurrentes y se define por una dilatación bronquial irreversible de diversas etiologías. [1]. Es el resultado de una interacción compleja entre la inmunidad del huésped, el patógeno y el medio ambiente. [2]. La inmunidad disfuncional del huésped frente a especies virales, bacterianas o fúngicas conduce a inflamación crónica, remodelación pulmonar y daño del epitelio pulmonar asociado con infecciones recurrentes y alteración de la eliminación de patógenos. La bronquiectasia es un punto final patológico que consiste en una dilatación anormal de los bronquios y bronquiolos. La extensión de las bronquiectasias puede variar desde enfermedad focal, limitada a un segmento o lóbulo, hasta enfermedad difusa, que involucra ambos pulmones en todos los lóbulos. [3]. Los pacientes con bronquiectasias graves asociadas con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), sibilancias, hipertensión pulmonar, insuficiencia respiratoria crónica y hemoptisis potencialmente mortal [4].

La lista de afecciones que se sabe que causan bronquiectasias es larga, pero la mayoría comparte características comunes. La vía fisiopatológica generalmente comienza con una depuración mucociliar alterada que promueve el establecimiento de infecciones crónicas. Los cilios se clasifican en móviles o primarios. Los cilios móviles son células epiteliales bien diferenciadas, mientras que los cilios primarios no son móviles y están implicados en la regulación de procesos fundamentales en el desarrollo. El análisis de la diferenciación de células epiteliales de las vías respiratorias mostró que las células ciliadas móviles se originan a partir de células ciliadas primarias [5]. Se ha detectado la expresión de policistina-1 (PC1) en los cilios primarios y móviles de las vías respiratorias y aumenta notablemente durante la diferenciación, lo que sugiere que PC1 regula la diferenciación de los cilios en los pulmones. [5]. PC1 es una gran proteína unida a la membrana que se expresa en los cilios y actúa como un mecanosensor de señales extracelulares. Su deficiencia se asocia con la disminución de las concentraciones de calcio intracelular, lo que da lugar a la cistogénesis a través de la activación de las vías de proliferación y secreción. [6]. PC1 está codificada por la enfermedad renal poliquística 1 (PKD1), y PKD1 mutaciones causan enfermedad renal poliquística autosómica dominante (ADPKD) [7]. La ADPKD es un trastorno genético hereditario en el que la anomalía ciliar primaria en las células epiteliales renales da como resultado hipertrofia celular, hiperplasia y formación de quistes. [8]. Dado que los pacientes con ADPKD también tienen bronquiectasias, sugiere que existe un vínculo entre los cilios, los procesos de señalización celular y las bronquiectasias. [9]. Por lo tanto, ADPKD es una ciliopatía más que una enfermedad renal. La investigación molecular es imprescindible para desarrollar nuevas herramientas terapéuticas [10] y para comprender mejor la historia de la enfermedad [11]. Durante el proceso de generación de quistes, muchas vías de señalización están involucradas, incluidas las vías MAPK, mTOR, Wnt, STAT3, Smyd2 y TGFβ. [6, 8]. Sin embargo, el papel de PC1 en contribuir al aumento de la prevalencia de bronquiectasias en pacientes con ADPKD sigue sin descubrirse.

La identificación de la etiología de las bronquiectasias es de gran importancia para guiar el tratamiento, y el descubrimiento de los mecanismos que subrayan la patogenia de las bronquiectasias se basa en gran medida en modelos animales. La ligadura del lóbulo apical se usó una vez para generar bronquiectasias en ratas Wistar exogámicas en 1989 [12]. Aunque la respuesta inmunitaria celular estaba presente como en los pacientes humanos, este modelo no simuló las bronquiectasias idiopáticas. En 2014, los cilios de las vías respiratorias se eliminaron por inactivación de IFT88 en ratones, lo que provocó bronquiectasias. [13]. Sin embargo, no hubo cambios significativos en la respuesta inflamatoria y las secreciones mucosas respiratorias, lo que contrasta con los pacientes con bronquiectasias. Hoy en día, el desarrollo de nuevas terapias para las bronquiectasias tiene muchos desafíos y está muy limitado por la falta de un modelo animal adecuado de bronquiectasias. [14]. Por lo tanto, es necesario un modelo animal ideal para las bronquiectasias para estudiar y desarrollar nuevas terapias.

En términos de tamaño corporal, anatomía, metabolismo, fisiología y respuestas fisiopatológicas, el cerdo es un modelo atractivo para la investigación biomédica [15]. En estudios previos, hemos generado la PKD1+/− cerdos para simular la progresión de la formación de quistes y alteraciones fisiológicas similares a las observadas en pacientes con ADPKD [16]. El objetivo de este estudio fue investigar el mecanismo de las bronquiectasias en la ADPKD causada por PKD1 deficiencia. Al analizar el PKD1 pulmones de cerdo deficientes, identificamos bronquiectasias y descubrimos que la expresión de E-cadherina estaba disminuida en las células epiteliales de las vías respiratorias, lo que a su vez promovía el daño de la barrera celular y una respuesta inflamatoria agravada. La alteración de los componentes de la matriz extracelular (MEC) en PKD1+/− epitelial condujo a un cambio de fenotipo de las células del músculo liso de las vías respiratorias y resultó en la remodelación de las vías respiratorias y la formación de bronquiectasias. los PKD1+/− El modelo de cerdo proporcionó una herramienta valiosa para descubrir el mecanismo de progresión de las bronquiectasias, y el papel de PKD1 en el epitelio pulmonar sugirió un objetivo potencial para desarrollar una nueva estrategia para el tratamiento de las bronquiectasias.

materiales y métodos

modelos animales

los PKD1+/− Los minicerdos experimentales chinos (CEMP) se generaron en estudios anteriores [16]. La especie porcina (CEMP) fue criada por la Universidad Agrícola de China. Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de Bienestar Animal de China y se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad Agrícola de China (Número AW10201202-3-1).

Líneas celulares y cultivo celular.

La línea de células epiteliales de pulmón humano (H1299) y la línea de células de fibroblastos de pulmón fetal humano (MRC5) se adquirieron en China Center for Type Culture Collection, China. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 o DMEM suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Gibco, EE. UU.), 100 U/mL de penicilina y 100 µg/mL de estreptomicina (Gibco, EE. UU.) a 37 °C en aire humidificado que contenía 5 % de CO2. Se disolvió colágeno I (Sigma-Aldrich, EE. UU.) en ácido acético 0,1 mM para obtener una solución de 50 µg/ml como solución madre. Las superficies de las placas de cultivo celular de seis pocillos se recubrieron con colágeno I (0,5 ml/pocillo) durante la noche y se secaron a temperatura ambiente. Las células MRC5 se sembraron en placas recubiertas de colágeno (75.000 células/pocillo) y el medio se actualizó cada 48 h. Al llegar a la confluencia, las células se recogieron para análisis.

Generación de PKD1KD

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