Lijiao Zhang, Danyang Li, Chun Chang, Yongchang Sun
Departamento de Medicina Respiratoria y de Cuidados Críticos, Tercer Hospital de la Universidad de Pekín, Pekín, 100191, República Popular de China
Correspondencia: Yongchang Sun, correo electrónico [email protected]
Objetivo: La disfunción del músculo esquelético es una comorbilidad importante en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y se asocia con una mala calidad de vida y una reducción de la supervivencia, pero los mecanismos implicados siguen siendo esquivos. La ferroptosis es un tipo de muerte celular recién descubierta que resulta de la acumulación de peróxido de lípidos dependiente de hierro. El propósito de este estudio fue examinar si la ferroptosis está involucrada en la disfunción del músculo esquelético asociada con la EPOC.
Métodos: Se estableció un modelo de ratón de la EPOC después de 24 semanas de exposición al humo del cigarrillo (CS), y se utilizaron la secuenciación del ARNm, la tinción con hematoxilina-eosina (H&E), la inmunotinción (IF), la RT-PCR y la transferencia Western para identificar los cambios en el gastrocnemio. músculos. In vitro, los miotubos C2C12 se trataron con extracto de CS (CSE) y se evaluaron las moléculas relacionadas con la ferroptosis. Luego se exploraron las vías que regulan la ferroptosis en miotubos estimulados por CSE.
Resultados: En comparación con los controles, los ratones con EPOC mostraron una vía de ferroptosis enriquecida. gpx4 disminuyó, mientras que el factor inducible por hipoxia (Hif) 2α se incrementó, a nivel de genes y proteínas. Un nivel reducido de GSH, pero aumento de la muerte celular, Fe2+, lípidos ROS, LPO y 4-HNE se observaron en ratones con EPOC o en miotubos C2C12 estimulados con CSE, que podrían mejorarse con inhibidores de ferroptosis. La expresión de miostatina (MSTN) se mejoró en ratones con EPOC y miotubos estimulados con CSE. MSTN reguló al alza la expresión de HIF2α y condujo a ferroptosis en miotubos, mientras que la inhibición de la unión de MSTN a su receptor o la inhibición/desactivación de HIF2α resultó en una disminución de la muerte celular y restauró parcialmente GPX4 y GSH.
Conclusión: La exposición a CS indujo ferroptosis in vivo e in vitro. Mecánicamente, la exposición a CS reguló al alza la MSTN, lo que indujo aún más la ferroptosis a través de HIF2α en los músculos esqueléticos, lo que puede contribuir a la disfunción muscular al afectar la capacidad metabólica y disminuir el número de fibras musculares, lo que revela un nuevo objetivo terapéutico potencial para la disfunción del músculo esquelético relacionada con la EPOC.
Palabras clave: enfermedad pulmonar obstructiva crónica, disfunción del músculo esquelético, ferroptosis, miostatina, factor 2α inducible por hipoxia
Introducción
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad crónica de las vías respiratorias de prevalencia mundial y es la tercera causa de muerte en todo el mundo.1 Como una enfermedad muy heterogénea asociada principalmente con el tabaquismo y el envejecimiento, la EPOC se considera una enfermedad sistémica con múltiples comorbilidades intrapulmonares y extrapulmonares, algunas de las cuales ocurren independientemente de la EPOC, pero otras pueden estar causalmente relacionadas con la EPOC.1 La sarcopenia/disfunción del músculo esquelético es una de las comorbilidades importantes de la EPOC y tiene un impacto significativo en la calidad de vida de los pacientes, la gravedad de la enfermedad, la hospitalización y la mortalidad.2–4 La prevalencia de disfunción musculoesquelética en pacientes con EPOC estable fue del 14,5%2 al 55%.5 La disfunción del músculo esquelético es más frecuente en individuos con enfisema y más significativa en las extremidades inferiores, lo que afecta la capacidad deambulatoria de los pacientes, lo que lleva a la atrofia muscular en desuso, creando un círculo vicioso.4 A diferencia de las lesiones pulmonares destructivas irreversibles, la adaptabilidad inherente de los músculos esqueléticos ofrece oportunidades terapéuticas para abordar la disfunción del músculo esquelético en pacientes con EPOC.6 Sin embargo, los mecanismos de la disfunción del músculo esquelético relacionada con la EPOC no se han dilucidado por completo.
Varias vías de señalización pueden estar involucradas o contribuir a la disfunción del músculo esquelético relacionada con la EPOC, como la vía catabólica de la proteína dependiente de la ubiquitina mediada por proteasoma (vía de la ubiquitina-proteasoma),7 vía autofagia-lisosoma,8 NF-κB y citoquinas inflamatorias,9 y la vía de la miostatina (MSTN)-Smad3,7 entre los cuales predominó la vía ubiquitina-proteasoma en la proteólisis muscular. Como importantes ligasas de ubiquitina E3 específicas del músculo, la proteína Ring finger 1 específica del músculo (MuRF1, también conocida como TRIM63) y Atrogin1 (también conocida como FBXO32) median la proteólisis muscular, y la pérdida de cualquiera de ellas puede aliviar la atrofia muscular.10 Además, se encontró una transformación del tipo de fibra de contracción lenta a rápida en los músculos periféricos de los pacientes con EPOC, lo que resultó en un deterioro de la capacidad antifatiga del músculo esquelético y una disminución del metabolismo aeróbico.4
La ferroptosis es una forma de muerte celular regulada y dependiente de hierro caracterizada por la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y daño masivo de la membrana celular mediado por la peroxidación lipídica (LPO).11 El eje glutatión (GSH)-glutatión peroxidasa 4 (GPX4) desempeña un papel protector en la ferroptosis que puede desencadenarse por moléculas que inhiben la biosíntesis de GSH o enzimas antioxidantes dependientes de GSH.11 El GSH, el antioxidante endógeno más abundante en las células de los mamíferos, se genera a partir de la cisteína, que se puede obtener en su forma oxidada cisteína a través del sistema amino antiportador Xc− (un complejo proteico transmembrana que consta de la subunidad de cadena ligera SLC7A11 y la subunidad de cadena pesada SLC3A2), o en su forma reducida cisteína a partir de metionina a través de la vía de transsulfuración.12 Cuando GSH es insuficiente, el exceso de peróxido conduce a LPO. La LPO desenfrenada es el sello distintivo de la ferroptosis, en la que el hierro es esencial. El músculo esquelético contiene del 10 al 15% del contenido total de hierro del cuerpo humano. Se ha confirmado que la acumulación excesiva de hierro podría alterar la función celular normal a través del estrés oxidativo y la catálisis de radicales hidroxilo tóxicos.13
La senescencia celular se considera actualmente como un mecanismo importante que subyace en la patogenia de la EPOC, y el humo del cigarrillo (CS) puede actuar como inductor de la senescencia.14 La creciente evidencia ha demostrado que la ferroptosis está implicada en el desarrollo y/o progresión de muchas enfermedades relacionadas con la edad,15 y que se ha encontrado acumulación de hierro relacionada con la edad en los músculos esqueléticos de modelos animales de sarcopenia y pacientes de edad avanzada.dieciséis
Por lo tanto, en base a esta evidencia, especulamos que la ferroptosis puede estar involucrada en la patogénesis de la disfunción del músculo esquelético relacionada con la EPOC. Por lo tanto, investigamos la ferroptosis y las moléculas potenciales involucradas en su regulación en músculos esqueléticos de ratones con EPOC inducida por exposición a CS y en un modelo in vitro. Encontramos que la exposición a CS indujo ferroptosis en músculos esqueléticos de ratones y en miotubos C2C12. La exposición a CS reguló la expresión de MSTN, que indujo ferroptosis a través de HIF2α en las células del músculo esquelético. Estos hallazgos revelaron un nuevo vínculo mecánico entre la EPOC y la disfunción del músculo esquelético.
Materiales y métodos
Modelo de COPD en ratón inducido por humo de cigarrillo
Se compraron ratones C57BL/6 de la misma edad (de 6 a 8 semanas de edad) en Beijing Vital River Laboratory o Charles Rivers Laboratories y se mantuvieron en instalaciones ventiladas para animales libres de patógenos específicos. Todos los procedimientos y el manejo de animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Pekín (No. LA2021545) de acuerdo con las Directrices de China sobre Bienestar y Revisión Ética para Animales de Laboratorio. Todos los ratones se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h con acceso ad libitum a alimento y agua. El modelo de ratón de la EPOC se estableció utilizando un método de exposición al consumo de cigarrillos solo por la nariz, como se informó anteriormente.17 Brevemente, los ratones fueron expuestos simultáneamente a cigarrillos con filtro (10 mg de alquitrán, 0,9 mg de nicotina, 12 mg de CO) dos veces al día durante 50 minutos cada vez, con intervalos de 20 minutos sin fumar, 5 días a la semana, durante 24 semanas. utilizando un sistema de exposición al humo solo por la nariz (SG-300; SIBATA, Tokio, Japón). Los cigarrillos se quemaron activamente y se generó humo mediante una succión controlada por computadora, con 20 ml de humo por 8 segundos en la cámara de exposición. Se obtuvo la relación humo:aire óptima de 1:9. Los ratones de control fueron expuestos a aire filtrado. Después de 24 semanas de exposición a CS, los ratones se sometieron a pruebas de función pulmonar y evaluación morfométrica de secciones de pulmón para verificar el modelado exitoso de la EPOC.
Prueba de función pulmonar
La función pulmonar de los ratones se realizó mediante dispositivos de respiración animal (AniRes2005, Bolan Technology, Beijing, China). Brevemente, los ratones se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 3% (0,6 mg/10 g). Se realizó una traqueotomía y se insertó una cánula en la tráquea laríngea. Los ratones fueron ventilados con un volumen tidal de 10 ml/kg, una frecuencia respiratoria de 500 respiraciones/min y una presión positiva al final de la espiración de 2 cmH2O. Capacidad vital forzada (FVC), volumen espiratorio forzado en 0,1 s (FEV0,1), flujo espiratorio forzado al 25 % de FVC (FEF25 %), FEF75 %, FEF25-75 %, distensibilidad pulmonar y resistencia de los pulmones (RL) fueron medidos.18
Prueba de fuerza de agarre
La prueba de fuerza de agarre se realizó para medir la fuerza muscular de cuatro extremidades de los ratones usando un medidor de fuerza de agarre (unibiolab, Beijing, China). El ratón estaba agarrando la barra de malla conectada a un transductor de fuerza con las cuatro extremidades. Luego, el ratón fue tirado hacia atrás por la cola a una velocidad constante hasta que se soltó. El transductor registró automáticamente la fuerza máxima (g). Cada ratón se probó 4 veces, con un intervalo de descanso de 2 minutos entre cada prueba. La media de cuatro mediciones se registró como fuerza de agarre.
Análisis histológico de los pulmones y los músculos esqueléticos del ratón
Después de la prueba de función pulmonar, se recogió el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Luego, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Los tejidos pulmonares y los músculos gastrocnemios de las extremidades posteriores se fijaron durante 24 h en paraformaldehído al 4% y luego se incluyeron en parafina. El tejido pulmonar se seccionó con un grosor de 5 μm para la tinción con H&E. Luego, se evaluaron la intersección lineal media (MLI) y el índice destructivo (DI) del tejido pulmonar para determinar el grado de enfisema, siguiendo nuestro estudio anterior.19 Específicamente, MLI se midió utilizando una cuadrícula de 100 × 100 μm que pasaba aleatoriamente a través de los alvéolos y se calculó la longitud total de cada línea de la cuadrícula dividida por el número de intersecciones alveolares. La medición de DI se realizó mediante una cuadrícula con 42 puntos ubicados en el centro de cruces finas superpuestas en el campo pulmonar. Las estructuras situadas bajo estos puntos se marcaron como espacios alveolares y/o ductales normales (N) o destruidos (D). Los puntos que caen sobre otras estructuras, como paredes de conductos y paredes alveolares, no se incluyeron en los cálculos. DI se calculó como D/(D+N). Las secciones transversales de 10 μm de espesor se cortaron del músculo gastrocnemio incluido en parafina mediante un criostato (Leica, Solms, Alemania) y se tiñeron con H&E.
Tinciones de inmunofluorescencia (IF)
Los tejidos del músculo esquelético incrustados en parafina se seccionaron a un espesor de 5 µm. Luego, los portaobjetos de parafina fueron desparafinados y rehidratados a través de una serie de alcoholes graduados hasta que se usó agua. Los portaobjetos se sometieron a recuperación de antígenos en un baño de agua termostático, a 95°C durante 15 min, y se bloquearon con suero de cabra al 5% en TBST a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, las muestras se incubaron con anticuerpos primarios diluidos 1000 veces en tampón de bloqueo a 4 °C durante la noche, seguidos de lavados con PBS 1x 3 veces, incubación con anticuerpo secundario diluido 1000 veces (IgG de cabra anti-conejo (H+L ) anticuerpo secundario altamente adsorbido en cruz-Alexa Fluor 647) y DAPI en tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 h, y lavado con 1x PBS durante 3 veces. Los anticuerpos primarios incluyeron anticuerpo primario anti-cadena pesada de miosina esquelética lenta (MyHC) (GB111858, Servicebio, Wuhan, China), anticuerpo primario anti-4 hidroxinonenal (4-HNE) (ab46545, Abcam, Cambridge, Reino Unido), anti-GPX4 anticuerpo primario (AF7020, Beyotime, Shanghai, China) y DAPI (Beyotime, Shanghai, China). La expresión de MyHC esquelético lento, 4-HNE y GPX4 en los músculos esqueléticos se imaginó bajo un microscopio de fluorescencia.
Preparación de extracto de humo de cigarrillo
Extracto de humo de cigarrillo (CSE)…
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