La inhibición de RAGE alivia la lesión pulmonar inducida por lipopolisacáridos mediante la supresión directa de la apoptosis autofágica de las células epiteliales alveolares tipo II

by | Ene 24, 2023 | 0 comments

Resumen

Fondo

El receptor del producto final de la glicación avanzada (RAGE) actúa como un receptor de ligandos proinflamatorios y se expresa en gran medida en las células epiteliales alveolares (AEC). La autofagia en AEC ha recibido mucha atención recientemente. Sin embargo, los roles de la autofagia y RAGE en la patogenia de la lesión pulmonar aguda siguen sin estar claros. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo explorar si las señales de activación de RAGE participan en la disfunción de la barrera epitelial alveolar a través de la muerte autofágica.

Métodos

Se establecieron modelos animales de lesión pulmonar aguda utilizando C57BL/6 y Àger gen knockout (Àger −/− ratones) ratones en este estudio. Las células A549 y las células epiteliales alveolares primarias tipo II (ATII) se trataron con siRNA para reducir Àger la expresion genica. La autofagia fue inhibida por 3-metiladenina (3-MA). La lesión pulmonar se evaluó mediante examen histopatológico. La viabilidad celular se estimó mediante el ensayo del kit de recuento de células 8 (CCK-8). Los niveles de suero y líquido de lavado broncoalveolar (BALF) de interleucina (IL)-6, IL-8 y RAGE soluble (sRAGE) se evaluaron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La participación de las señales RAGE, la autofagia y la apoptosis se evaluó mediante transferencias Western, inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, microscopía electrónica de transmisión y prueba TUNEL.

Resultados

La expresión de RAGE fue promovida por lipopolisacárido (LPS), que se asoció con la activación de la autofagia tanto en tejidos pulmonares de ratones y células A549 como en células ATII primarias. sRAGE en BALF se correlacionó positivamente con los niveles de IL-6 e IL-8. En comparación con los ratones de tipo salvaje, la inflamación y la apoptosis en los tejidos pulmonares se aliviaron en Àger−/− ratones. La autofagia persistentemente activada contribuyó a la apoptosis celular, mientras que la inhibición de la autofagia por 3-MA protegió a los pulmones del daño. Además, Àger La caída inhibió la activación de la autofagia inducida por LPS y atenuó la lesión pulmonar. In vitro, la eliminación de RAGE suprimió significativamente la activación de la autofagia inducida por LPS y la apoptosis de A549 y las células ATII primarias. Además, RAGE activó la vía de señalización STAT3 aguas abajo.

Conclusión

RAGE juega un papel esencial en la patogénesis de la lesión de las células ATII. Nuestros resultados sugirieron que la inhibición de RAGE alivió la lesión pulmonar inducida por LPS al suprimir directamente la apoptosis autofágica de las células epiteliales alveolares.

Fondo

La lesión pulmonar aguda (ALI) y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) secundarios a una infección pulmonar primaria contribuyen significativamente a la morbilidad y la mortalidad [1]. La lesión de las células epiteliales alveolares (AEC, por sus siglas en inglés) es un sello distintivo crítico de ALI/ARDS, que cubre más del 95 % del área de la superficie interna del pulmón [2]. La exploración de los mecanismos potenciales de la lesión de las células epiteliales pulmonares puede proporcionar nuevos conocimientos sobre el SDRA.

La infección por bacterias gramnegativas es una de las causas más importantes de ALI/ARDS, y el lipopolisacárido (LPS), el principal componente de las membranas externas de las bacterias gramnegativas, puede causar lesiones pulmonares e inducir una respuesta inflamatoria [3]. ALI/ARDS inducido por LPS en ratones se ha convertido en un modelo reconocido para estudiar ALI/ARDS, porque simula eventos patológicos como la inflamación y los cambios histológicos observados en esta enfermedad [4]. El receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE) es un receptor de reconocimiento de patrones transmembrana que se expresa en mamíferos y pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig). [5]. Se expresa fuertemente en las AEC y actúa como marcador de lesión epitelial. [6]. Como sensor inmunitario innato, RAGE puede reconocer patrones moleculares asociados a patógenos microbianos, incluido el LPS bacteriano [7]. Se ha informado que la señalización RAGE/NF-κB está involucrada con la lesión pulmonar inflamatoria inducida por LPS [8]. Además, los ratones knockout para RAGE mostraron una mejora notable en la eliminación de líquido alveolar y la fuga de albúmina vascular pulmonar en respuesta a LPS [9]. Se descubrió que los inhibidores de RAGE FPS-ZM1 y Azeliragon son efectivos para reparar el daño del epitelio de las vías respiratorias inducido por LPS. [10]. Las principales formas solubles de RAGE carecen de un dominio transmembrana, denominado RAGE soluble (sRAGE), tiene una buena utilidad de diagnóstico y se asocia con la gravedad de la lesión pulmonar en entornos clínicos. El sRAGE plasmático elevado se asoció con una mayor mortalidad en pacientes con ARDS [11]. Sin embargo, diferentes investigaciones han demostrado que la administración de sRAGE mejoró drásticamente la mortalidad inducida por LPS al reducir el daño tisular y la liberación de citoquinas en modelos de ratones. [12]. Se ha demostrado que el RAGE humano recombinante reduce el edema pulmonar, la infiltración de neutrófilos y la secreción de factores inflamatorios en un modelo de rata de ALI inducida por LPS [13]. Aunque RAGE se ha investigado en varias enfermedades pulmonares y tal vez sea un regulador crítico de las respuestas inflamatorias pulmonares [14], los hallazgos de la investigación actual sobre RAGE son inconsistentes. Además, en los modelos ALI/ARDS, el epitelio alveolar sufre un daño más directo debido a la infección pulmonar primaria. Por lo tanto, el papel de RAGE en el epitelio alveolar necesita más exploración.

La autofagia en AEC ha atraído una atención cada vez mayor, particularmente con respecto a la lesión pulmonar causada por neumoconiosis y nanopartículas. [15, 16]. Sin embargo, existe un papel paradójico de la autofagia en la lesión pulmonar causada por una infección o inflamación aguda. En investigaciones anteriores, las proteínas autofágicas se redujeron bajo la estimulación con LPS a través de la activación de las señales del objetivo de rapamicina de mamíferos (mTOR) en el epitelio de las vías respiratorias del ratón y las células epiteliales bronquiales humanas, la sobreactivación de la autofagia o la caída genética de mTOR redujeron significativamente la liberación de interleucina (IL) -6 e IL-8 [17]. Por el contrario, un estudio reciente sugirió que la activación de la autofagia inducida por LPS en AEC y la inhibición de la autofagia protegen de las lesiones inflamatorias [18]. Estos estudios mostraron que la autofagia en AEC juega un papel importante en ALI, sin embargo, el mecanismo subyacente permanece para futuras investigaciones. La evidencia sugiere que la inhibición de RAGE ejerce un efecto terapéutico en animales con ARDS al restaurar la permeabilidad epitelial alveolar y la eliminación de líquido pulmonar [19]. Curiosamente, se informó que RAGE media la autofagia que participa en la patogénesis de diferentes enfermedades pulmonares, incluida la ALI. [20]. Un estudio reciente encontró que la supresión de la autofagia mejoró la viabilidad de las células epiteliales pulmonares y las uniones estrechas [21]. Sin embargo, el papel de RAGE en la autofagia de células epiteliales sigue sin estar claro.

Este estudio, por lo tanto, tuvo como objetivo investigar el papel potencial de RAGE en la regulación de la autofagia en células ATII de modelos ALI/ARDS. Demostramos que la activación de la autofagia en las células ATII cambió de manera dependiente del tiempo, y que la autofagia excesiva intensificó la muerte celular de manera dependiente de RAGE. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que demuestra que RAGE es un mediador fundamental de la activación de la autofagia de las células ATII en respuesta a las endotoxinas.

Métodos

Modelos animales experimentales de ALI

Se compraron ratones C57BL/6 macho (8–9 semanas de edad) del Centro de Organismos Modelo de Shanghái (Shanghai, China) y se asignaron al azar a los grupos. En el laboratorio, los ratones se mantuvieron en una jaula ventilada en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h/12 ​​h a 25 °C con una humedad del 45-55 %. Los ratones tenían libre acceso a comida y agua. Se indujo ALI/ARDS en ratones mediante inyección intratraqueal de LPS (10 mg/kg, Escherichia coli 0111:B4, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE. UU.). Se anestesiaron ratones macho mediante inyección intraperitoneal (ip) con una solución de pentobarbital sódico al 1% (50 mg/kg, Instituto Biyuntian de Biotecnología, Haimen, China). Los tórax de los ratones se sometieron a una irradiación vertical de campo único de 0 grados de rayos X de tórax.

Para obtener el mejor modelo, los ratones fueron sacrificados a las 0, 2, 6, 12, 24 y 48 h después del tratamiento con LPS. Para explorar el efecto de la inhibición de la autofagia, los ratones se trataron con 3-MA (35 mg/kg, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE. UU., ip) durante 8 h antes del tratamiento con LPS. Para explorar si…

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