La microbiota intestinal modula la respuesta a la lesión pulmonar aguda inducida por bleomicina en ratones

Fondo

La instilación de bleomicina (BLM) en las vías respiratorias en ratones es un modelo ampliamente utilizado, pero desafiante, para la lesión pulmonar aguda (ALI) con una alta variabilidad en el esquema de tratamiento y los resultados en animales entre los investigadores. Actualmente se desconoce si la microbiota intestinal juega algún papel en el resultado de la lesión pulmonar inducida por BLM.

Métodos

Se realizó la instilación intratraqueal de BLM en ratones C57BL/6. Los microbiomas fecales se analizaron mediante amplificación de ARNr 16s y secuenciación metagenómica. Se realizó la convencionalización de ratones libres de gérmenes y la transferencia de microbiota fecal entre ratones SPF para determinar las especies comensales dominantes que están asociadas con una respuesta BLM más severa. Además, los pulmones y los ganglios linfáticos que drenan el intestino de los ratones se analizaron mediante citometría de flujo para definir inmunofenotipos asociados con el microbioma sensible a BLM.

Resultados

Los ratones de dos instalaciones de barrera SPF en la Universidad de Chicago exhibieron una mortalidad y pérdida de peso significativamente diferentes durante la lesión pulmonar inducida por BLM. La convencionalización de ratones libres de gérmenes con microbiota SPF de dos instalaciones de alojamiento diferentes recapituló la respuesta de los respectivos donantes a BLM. La transferencia de microbiota fecal de la instalación donde los ratones tenían una peor mortalidad a los ratones en la instalación con más supervivencia hizo que los ratones receptores fueran más susceptibles a la pérdida de peso inducida por BLM de una manera negativa dominante. El fenotipo sensible a BLM se asoció con la presencia de Helicobacter y desulfovibrio en el intestino, disminución del eje de neutrófilos Th17 durante el estado estacionario y aumento de la acumulación de neutrófilos en los pulmones durante la fase aguda de la respuesta a la lesión.

Conclusión

La composición de la microbiota intestinal tiene un impacto significativo en el desgaste y la muerte inducidos por BLM, lo que sugiere un papel del eje pulmón-intestino en la lesión pulmonar.

La creciente evidencia basada en estudios clínicos y experimentales sugiere que el microbioma desempeña un papel esencial en las afecciones pulmonares inflamatorias, como la lesión pulmonar aguda (ALI) y el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Caracterizado por inflamación pulmonar aguda y difusa, el desarrollo de ARDS se asocia con mayor frecuencia con neumonía inducida por infección respiratoria, sepsis no pulmonar, aspiración de contenido gástrico y/o esofágico y traumatismo mayor. [1,2,3]. En estudios recientes, se demostró que el enriquecimiento de especies comensales específicas en la comunidad del microbioma pulmonar está estrechamente relacionado con el desarrollo y el resultado del SDRA entre pacientes en estado crítico [4,5,6]. bacterias entéricas enterobacterias se encontraron en los pulmones de pacientes con ARDS incluso en ausencia de una infección bacteriana sistémica, lo que sugiere que la translocación de bacterias comensales del intestino al pulmón puede alterar la microbiota pulmonar y afectar la salud pulmonar [4, 7]. Además, los comensales intestinales anaeróbicos, incluidos Bacteroides y enterococo faecalis se encontraron abundantemente en los pulmones y se correlacionaron con la supervivencia en un modelo experimental de sepsis [4]. Por lo tanto, comprender el efecto del microbioma sobre la lesión y la inflamación pulmonar podría conducir a mejores estrategias de predicción y tratamiento para los pacientes con SDRA.

La instilación intratraqueal de bleomicina (BLM) en ratones es un modelo comúnmente utilizado de lesión pulmonar y fibrosis. A diferencia de la infección bacteriana sistémica, el modelo BLM induce lesiones estériles sin el uso de ningún agente infeccioso o componente bacteriano. BLM es un antibiótico contra el cáncer, que se aisló originalmente del actinomiceto Streptomyces verticillus [8]. Induce la muerte celular al generar especies reactivas de oxígeno y roturas de ADN de doble cadena, lo que conduce principalmente a lesiones epiteliales. [8,9,10]. La respuesta a la administración intratraqueal de BLM en animales se caracteriza por dos fases, aguda y fibrosa. La alveolitis neutrofílica y el aumento de la permeabilidad pulmonar tienen lugar durante los primeros 7 a 11 días de la fase aguda posterior a la lesión, seguida de una fase fibrótica con contracción de la inflamación. [8, 11, 12]. Aunque el modelo BLM se ha perfeccionado a lo largo de los años, la dosis de BLM utilizada para inducir patología en animales varía ampliamente entre los investigadores. [13]. La necesidad de una cantidad variable de BLM incluso para la misma cepa de ratones sugiere que algunos factores ambientales, como la dieta y el microbioma, pueden contribuir a la susceptibilidad a la lesión pulmonar inducida por BLM.

Estudios anteriores mostraron que los animales libres de gérmenes están protegidos de la mortalidad inducida por BLM, lo que sugiere que el microbioma desempeña un papel fundamental en el modelo BLM [6, 14]. Sin embargo, en el contexto del desafío BLM, se desconoce el efecto de la diferencia espontánea en la composición de los microbios comensales en entornos libres de patógenos específicos (SPF). En este documento, investigamos la hipótesis de que las diferencias espontáneas en las comunidades microbianas intestinales entre animales genéticamente similares podrían contribuir a la variabilidad en la respuesta al desafío BLM. Nuestros hallazgos sugieren que la presencia de microbios comensales intestinales específicos puede ser un factor de riesgo para tener enfermedades pulmonares inflamatorias más graves y, además, resaltan la necesidad de definir entornos microbianos en los laboratorios para mejorar la reproducibilidad de los estudios experimentales de lesiones pulmonares.

Ganadería y cría

Se criaron y mantuvieron ratones C57BL/6 en dos instalaciones designadas para alojamiento de animales en la Universidad de Chicago. Ambas instalaciones se mantuvieron en el nivel de barrera SPF I con el uso de jaulas presurizadas positivamente y ventiladas individualmente con sistema automatizado de riego por ósmosis inversa. Las jaulas y las camas se esterilizaron en autoclave y se cambiaron en cabinas de seguridad biológica. Los ratones de la Instalación A recibieron NIH-31 Fórmula abierta modificada (7913, Harlan-Envigo, Indianápolis, IN), y los ratones de la Instalación B recibieron Teklad Global 18% Protein Rodent Diet (2918, Harlan-Envigo, Indianapolis, IN). Se criaron ratones receptores C57BL/6 libres de gérmenes machos de la misma edad en el Centro de Investigación Animal de Gnotobióticos de la Universidad de Chicago. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con el Protocolo de uso y cuidado de animales aprobado por IACUC.

modelo de bleomicina

La bleomicina para inyección USP (Teva Pharmaceuticals USA, Sellersville, PA) se reconstituyó a 3 U/mL en PBS libre de endotoxinas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. Los ratones se anestesiaron con ketamina y xilazina y se les administró por vía intratraqueal 1 U/kg de bleomicina en un volumen de 50 µl. Los ratones se pesaron diariamente y se sacrificaron si la pérdida de peso superaba el 25 % del peso original o si sus puntuaciones de bienestar disminuían.

Transferencia de microbiota fecal (FMT)

La convencionalización de ratones libres de gérmenes en las instalaciones de SPF se realizó agregando ropa de cama sucia y heces de jaulas de ratones vecinas en las respectivas instalaciones de SPF, dos veces por semana. Para FMT entre ratones SPF, se suspendieron gránulos fecales frescos de ratones donantes en 1 ml de PBS por gránulo (cada gránulo fecal pesaba 60–70 mg), y se combinaron 0,2 ml de suspensión fecal de cada donante y se pasaron a través de una aguja 18G 10 veces. Los ratones recibieron 0,2 ml de suspensión fecal agrupada mediante sonda oral, tres veces a la semana.

Análisis celular y citometría de flujo

Pulmones de ratón perfundidos se disociaron mediante picado seguido de digestión con 150 U/ml de colagenasa D (Gibco, Waltham, MA) y 0,02 mg/ml de DNasa I (Worthington, Lakewood, NJ) en 10 ml de DMEM más FCS al 5 % (X&Y Cell Culture, Kansas City, MO) durante 1,5 h. A continuación, las muestras se trataron con tampón de lisis ACK para eliminar los glóbulos rojos residuales. Para citometría de flujo, 0,5–1 × 10⁶ las células se suspendieron en 50 μl de tampón FACS, se bloquearon con sobrenadantes de hibridoma 2.4G2 (anti-CD16/32) y luego se tiñeron con anticuerpos de superficie durante 30 min a 4 °C. Para todas las tinciones intracelulares, las células se fijaron y permeabilizaron con Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Waltham, MA), y luego se tiñeron con anticuerpos intracelulares en tampón permanente durante la noche a 4 °C. Las células teñidas con anticuerpos se analizaron en un LSRFortessa (BD, Franklin Lakes, NJ) o Aurora (Cytek, Fremont, CA), y el análisis de datos se realizó con FlowJo (BD, Franklin Lakes, NJ)….