Las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano combinadas con pirfenidona aumentan la expresión de RGS2 en la fibrosis pulmonar en ratones

Objetivo

Se investigó el efecto terapéutico de las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical (hUC-MSC) en combinación con pirfenidona (PFD) sobre la fibrosis pulmonar en ratones y su posible mecanismo.

Métodos

Los ratones C57BL/6 se dividieron aleatoriamente en seis grupos: grupo de control, grupo modelo, P₁₀ grupo₃₀ grupo₁₀₀ grupo, y P₃₀₀ grupo. Modelado por intubación traqueal con goteo de 3 mg/kg de bleomicina, cada dosis de PFD se administró diariamente por sonda desde el día 7 en adelante. Los ratones se observaron continuamente durante 21 días y se registró la supervivencia. Los tejidos pulmonares se recolectaron el día 21 y se realizaron tinciones con hematoxilina-eosina (HE) y Masson para evaluar los cambios morfológicos y la deposición de colágeno en los pulmones. El contenido de colágeno se midió por el método Sircol y los niveles de marcadores de fibrosis se detectaron por PCR y Western blot. Luego, otro lote de ratones C57BL/6 se dividió aleatoriamente en cinco grupos: grupo de control hUC-MSC, grupo modelo, P₁₀₀ grupo de tratamiento con hUC-MSC y hUC-MSC + P₃₀ grupo. El día 7, 5×10⁵ Se inyectaron hUC-MSC en la vena de la cola, a los ratones se les administró alimentación forzada con PFD diariamente desde el día 7 en adelante y se registró su supervivencia. Los tejidos pulmonares se recolectaron el día 21 para detectar cambios patológicos, el contenido de colágeno y la expresión del regulador de señalización de proteína G 2 (RGS2). Los miofibroblastos pulmonares (MFB) se dividieron en un grupo MFB y un grupo MFB + hUC-MSC; se administraron diferentes dosis de PFD a cada grupo, y los niveles de RGS2, Ca intracelular²⁺y se registraron marcadores de fibrosis para cada grupo.

Resultados

En comparación con otras dosis del grupo PFD, la P₁₀₀ El grupo había mejorado significativamente la supervivencia del ratón y la patología pulmonar y había reducido significativamente los niveles de marcadores de colágeno y fibrosis (pags<0,05). Los hUC-MSC + P₃₀ El grupo había mejorado significativamente la supervivencia del ratón y la patología pulmonar, redujo significativamente el contenido de colágeno y los niveles de marcadores de fibrosis (pags< 0,05), y la eficacia fue mejor que la del P₁₀₀ y grupos hUC-MSCs (pags<0,05). La expresión de RGS2 fue significativamente mayor en las MSC + P₃₀ grupo en comparación con el P₁₀₀ y grupos hUC-MSCs (pags<0,05). PFD aumentó la expresión de RGS2 en MFB (pags< 0,05) de forma dependiente de la dosis. En comparación con el tratamiento de PFD y hUC-MSC solo, la combinación de hUC-MSC y PFD aumentó los niveles de proteína RGS2, disminuyó significativamente el Ca intracelular²⁺ concentración y redujo significativamente los marcadores de fibrosis.

Conclusión

Los hallazgos sugieren que las hUC-MSC combinadas con dosis bajas de PFD tienen un efecto terapéutico mejor que el de los dos tratamientos usados ​​por separado. Su efecto atenuante de la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones está relacionado con el aumento de RGS2.

La fibrosis pulmonar idiopática (FPI), una enfermedad inflamatoria difusa de las vías respiratorias bajas de etiología desconocida, es una enfermedad pulmonar intersticial crónica caracterizada por disnea progresiva y deterioro de la función pulmonar [1]. Su incidencia aumenta cada año; la mediana de supervivencia es de solo 2,5 a 3,5 años y el pronóstico es peor que el de muchos tipos de cáncer [2, 3].

La edición de 2015 de las guías de práctica clínica para el tratamiento de la FPI establece que se desaconseja enérgicamente el uso de prednisona, azatioprina, monoterapia con N-acetilcisteína, anticoagulantes, antagonistas del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, antagonistas del receptor de la endotelina e inhibidores de la 5-fosfodiesterasa en pacientes con IPF, y que solo hay cuatro medicamentos condicionales recomendados, que incluyen pirfenidona (PFD), nintedanib, terapia combinada con N-acetilcisteína y terapia antiácida [1]. Aunque la aparición de la DPF ha beneficiado a muchos pacientes con FPI, en la edición de 2015 de las guías de práctica clínica para el tratamiento de la FPI, la DPF se definió como un fármaco recomendado condicionalmente debido a su alta dosis efectiva, numerosos efectos adversos y eficacia solo en pacientes leves. FPI a moderada [1, 4, 5]. Por lo tanto, la monoterapia actual para la DSP no es efectiva, por lo que es importante encontrar un tratamiento mejorado.

La terapia celular basada en la tecnología de células madre ha sido una tendencia popular en los últimos años [6]. Las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSCs) son un tipo de células madre adultas con potencial de diferenciación multidireccional derivadas del mesodermo, y son ampliamente utilizadas debido a la simplicidad de su extracción, falta de restricciones éticas, fuerte propiedades inmunomoduladoras y baja inmunogenicidad [7, 8]. Se han realizado ensayos clínicos en todo el mundo con hUC-MSC para el tratamiento de diversas enfermedades sistémicas, lo que confirma la seguridad de las hUC-MSC en aplicaciones clínicas. [9,10,11]. Estudios recientes han demostrado que las hUC-MSC inducen la modulación inmunitaria y el control de la inflamación a través de la secreción paracrina de múltiples factores y microvesículas, que pueden reducir los factores profibróticos y el depósito de colágeno, produciendo efectos terapéuticos en modelos animales de fibrosis pulmonar temprana inducida por bleomicina [12, 13]; sin embargo, las hUC-MSC ofrecen efectos terapéuticos limitados en la última etapa de la fibrosis pulmonar [14].

RGS2 es un supresor de proteínas acopladas a proteína G que ha recibido una atención creciente en enfermedades fibróticas. [15,16,17]. Estudios recientes han encontrado que la expresión de RGS2 está significativamente regulada a la baja en modelos animales de fibrosis renal e hipertrofia cardíaca, lo que sugiere que RGS2 juega un papel importante en la regulación de la patogénesis de la fibrosis. [18, 19]. La expresión mejorada de RGS2 protege contra la fibrosis pulmonar en ratones, mientras que la eliminación de RGS2 promueve la fibrosis en ratones, lo que demuestra que RGS2 endógeno tiene una función antifibrótica y que RGS2 es la base del efecto antifibrótico de PFD [20]. Sin embargo, la función biológica de RGS2 en la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones y su mecanismo de acción rara vez se informan en la literatura.

En este estudio, establecimos un modelo de ratón de fibrosis pulmonar usando bleomicina para investigar los efectos de las hUC-MSC combinadas con dosis bajas de PFD al observar la tasa de supervivencia y los cambios patológicos pulmonares y al detectar el nivel de expresión de los marcadores de fibrosis pulmonar en los ratones. . Se combinaron PFD y hUC-MSC para actuar sobre los miofibroblastos (MFB) para observar el efecto de su combinación en la expresión de RGS2, que tiene efectos antifibróticos, para explorar preliminarmente el posible mecanismo del tratamiento combinado y proporcionar una base teórica para el tratamiento. de IPF con hUC-MSCs combinado con PFD.

Agrupación y tratamiento de animales.

Se compraron ratas macho C57BL/6 de grado SPF de 7 semanas de edad en el Centro de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Chongqing y se alojaron en una sala de cría de grado SPF a 22–26 ℃, 55–60 % de humedad y 12 h/día. rotación ligera; el modelado se inició después de 1 semana de adaptación.

Dividimos 60 ratas C57BL/6 en 6 grupos utilizando el método de números aleatorios: grupo de control (N), grupo modelo de bleomicina (B), P₁₀ grupo (10 mg/kg PFD, P₁₀), PAGS₃₀ grupo (30 mg/kg PFD, P₃₀), PAGS₁₀₀ grupo (100 mg/kg PFD, P₁₀₀), y P₃₀₀ grupo (300 mg/kg PFD, P₃₀₀). El modelo de fibrosis pulmonar se estableció goteando 3 mg/kg de bleomicina en los pulmones de ratones a la misma velocidad mediante intubación traqueal, y al grupo de control se le administró la misma cantidad de solución salina a la misma velocidad. Después de un modelado exitoso, a cada grupo de dosis de PFD se le administró una suspensión de 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg o 300 mg/kg de PFD (Adamas Reagents, China) por sonda desde el día 7 después del modelado, y el grupo de control Se administró un volumen igual de solución salina una vez al día hasta el día 21 después del modelado.

Otro lote de 60 ratones C57BL/6 se dividió en 6 grupos utilizando el método de números aleatorios: grupo de control (N), grupo de control de hUC-MSCs (N + M), grupo modelo de bleomicina (B), grupo de tratamiento de hUC-MSCs (B + M), P₁₀₀ grupo (100 mg/kg PFD, P₁₀₀) y hUC-MSC + P₃₀ grupo (hUC-MSCs + 30 mg/kg PFD, B + M + P₃₀). El modelaje fue…