Los perfiles de miARN de vesículas extracelulares de plasma distinguen las exacerbaciones de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la gravedad de la enfermedad

Introducción

Las características patológicas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) incluyen inflamación crónica y remodelación de las vías respiratorias pequeñas, así como destrucción del parénquima pulmonar, lo que da como resultado una limitación del flujo de aire incompletamente reversible.^1,2 Ahora reconocida como la tercera causa principal de muerte en todo el mundo,³ La EPOC también provoca una morbilidad significativa, lo que pone de relieve la urgente necesidad de identificar y reducir los factores de riesgo subyacentes.⁴ Varios factores influyen en el desarrollo y la progresión de la EPOC, siendo el tabaquismo el más conocido.⁵

Los síntomas clínicos que incluyen disnea, tos crónica, producción de esputo y exacerbaciones son características definitorias de la EPOC.⁶ Varios pacientes sufren exacerbaciones (definidas como el empeoramiento de los síntomas por encima de la línea de base habitual de un paciente) y pueden requerir intervención farmacológica y/u hospitalización.⁷ Las intervenciones farmacológicas dirigidas a reducir los síntomas, la frecuencia y la gravedad de las exacerbaciones incluyen el uso de broncodilatadores inhalados (para superar la obstrucción del flujo de aire), corticosteroides (como agentes antiinflamatorios) y antibióticos (infecciones bacterianas).⁵

Las exacerbaciones son complicaciones graves que aceleran el deterioro de la función pulmonar, reducen la calidad de vida y empeoran significativamente los resultados de supervivencia.⁸ Dada la falta de tratamientos curativos para la EPOC, la reducción de las exacerbaciones es un objetivo de tratamiento significativamente importante para prevenir la progresión rápida de la enfermedad. Se han probado muchos biomarcadores potenciales para la predicción de las exacerbaciones de la EPOC y la progresión general de la enfermedad;^9,10 sin embargo, dado que la EPOC es ampliamente reconocida como una enfermedad heterogénea compleja, todavía se necesitan biomarcadores adicionales.

Las vesículas extracelulares (EV) son partículas de bicapa lipídica de tamaño nanométrico liberadas por la mayoría de las células y detectadas en una variedad de fluidos corporales que incluyen sangre, orina y esputo.^11,12 Los vehículos eléctricos se han destacado por su potencial como nuevos biomarcadores de enfermedades debido a una serie de características favorables, incluida su estabilidad en los fluidos corporales, lo que refleja el microambiente y el estado fisiológico de su célula parental y la capacidad de empaquetar y transportar biomoléculas específicas de la enfermedad (p. ej., ADN, ARN, miARN y proteínas).¹³ En particular, los ARN cortos no codificantes conocidos como microARN (miARN) desempeñan un papel clave en la regulación de la expresión génica.¹⁴ además de ser altamente estable en plasma.¹⁵ Los estudios han destacado que los miARN específicos se pueden exportar selectivamente a vehículos eléctricos,^dieciséis mientras que otros atestiguan su influencia en los procesos biológicos de las células receptoras.¹⁷ La estabilidad y accesibilidad de los miARN EV en plasma los ha convertido en objetivos ideales para los estudios de biomarcadores.^18,19

Este estudio a pequeña escala tuvo como objetivo identificar biomarcadores de miARN EV en plasma de participantes con EPOC que pudieran distinguir entre enfermedad leve y grave (etapa GOLD de la EPOC) y entre enfermedad estable y exacerbación. La identificación de dichos miARN EV en plasma, que luego se validan en cohortes de pacientes independientes más grandes, podría tener una aplicación traslacional significativa en el tratamiento clínico de la EPOC.

Materiales y métodos

Demografía de la cohorte

Los participantes durante una exacerbación de la EPOC (n = 20) fueron reclutados consecutivamente dentro de los 4 días posteriores a la admisión en The Prince Charles Hospital, Brisbane, Australia. La inclusión se basó en un diagnóstico clínico de exacerbación grave de la EPOC (deterioro agudo de los síntomas de la EPOC que requiere hospitalización), según lo determinado por un médico torácico.²⁰ Se excluyeron los pacientes con otras enfermedades pulmonares comórbidas, incluido el asma predominante según el diagnóstico médico, el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar intersticial.²⁰ Otros veinte pacientes (pacientes ambulatorios con EPOC que tenían síntomas estables durante al menos 4 semanas) fueron reclutados como participantes en estado estable.²⁰

Los datos demográficos y clínicos de los participantes, incluidos el historial de tabaquismo, la función pulmonar, la estadificación GOLD y la prueba de evaluación de la EPOC (CAT), se obtuvieron de los registros médicos y en el momento del reclutamiento de los pacientes. tabla 1 enumera las características clínicas de los participantes.

tabla 1 Características clínicas de los participantes con EPOC exacerbada (n = 20) y estable (n = 20)

Recolección y procesamiento de sangre

Se obtuvo sangre periférica de 40 participantes con EPOC: 20 participantes durante un evento de exacerbación y un grupo separado de 20 participantes en un estado estable. El procesamiento de la sangre periférica para separar el plasma de la fracción de células sanguíneas se realizó como se describió anteriormente.¹⁸

Caracterización de vehículos eléctricos de plasma

Microscopio de transmisión por electrones

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) en vehículos eléctricos de plasma resuspendidos se subcontrató al Centro de Microscopía y Microanálisis de la Universidad de Queensland. Los detalles completos se pueden encontrar en línea Material suplementario sección de métodos en ‘Caracterización de vesículas extracelulares de plasma’.

Western Blot de marcadores EV

Se cuantificó la concentración de proteínas de los EV de plasma resuspendidos en 1X PBS utilizando el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (ThermoFisher Scientific, EE. UU.) antes de someterse a la transferencia Western para marcadores específicos de EV como se describió anteriormente.¹⁸

Aislamiento de plasma EV y extracción de ARN

Los vehículos eléctricos se aislaron de muestras de plasma descongelado con el kit miRCURY Exosome Serum/Plasma (QIAGEN, Hilden, Alemania), y el ARN total se extrajo con el kit miRNeasy Mini (QIAGEN, Hilden, Alemania) como se describió anteriormente.¹⁸

Perfilado de miARN de plasma EV

La transcripción inversa se realizó con el kit miRCURY LNA RT (QIAGEN, Hilden, Alemania), seguida de la evaluación de la expresión génica de miARN con los paneles de PCR miRCURY LNA miRNA Serum/Plasma Focus (QIAGEN, Hilden, Alemania) como se describió anteriormente.¹⁸ Se pueden encontrar más detalles en línea Material suplementario sección de métodos en ‘PCR cuantitativa usando miRCURY LNA Serum/Plasma Focus PCR Panels’.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se ejecutaron utilizando Statistical Package for Social Science (SPSS V.27.0) (IBM, NY, EE. UU.), DIANA-miRPath v.3.0 (8) y GeneGlobe (http://www.giagen.com/geneglobe) como se describió previamente.¹⁸ Los detalles completos están disponibles en línea Material suplementario sección de métodos en “Análisis estadísticos”.

Resultados

Características clínicas de los participantes con EPOC durante un evento de exacerbación versus estado estable

Se evaluaron las características clínicas entre los 20 pacientes que experimentaron una exacerbación y un grupo separado de 20 pacientes que se consideró que estaban en un estado estable (tabla 1). Ambas cohortes estaban compuestas por adultos mayores y ex fumadores con clasificación GOLD severa, con base en la espirometría. Las características clínicas, incluidos el sexo, la edad, los antecedentes de tabaquismo y los años del paquete, no fueron significativamente diferentes entre las cohortes con exacerbación y las estables.

Las características clínicas que se redujeron significativamente en la cohorte con exacerbaciones en comparación con la cohorte estable incluyeron indicadores de función pulmonar (FEV1% teórico, FEV1, FVC; p = 0,006, p = 0,001 y p = 0,0005, respectivamente), mientras que los estadios GOLD más graves (p = 0,021), la puntuación CAT (p = 0,001) y el marcador sanguíneo inflamatorio HS-CRP (p = 0,026) aumentaron significativamente en la cohorte con exacerbaciones en comparación con la cohorte estable.

Caracterización de vehículos eléctricos de plasma de participantes con EPOC exacerbada y aquellos en estado estable

Se aislaron EV en plasma de cuatro participantes con EPOC, dos durante un evento de exacerbación y otros dos participantes mientras estaban estables, y se caracterizaron mediante transferencia Western. El análisis de los “marcadores EV” establecidos mostró la presencia de la proteína CD9 y cantidades mínimas de flotillina-1 en el plasma EV de ambos participantes, sin ningún marcador detectable en el plasma crudo (Figura 1A). Un exosoma estándar de plasma humano como control positivo mostró proteína EV flotillina-1 y una banda mínima de CD9. La albúmina (control negativo) también estuvo presente en las muestras de EV de ambos participantes, en niveles similares a los del plasma sin procesar, lo que destaca este coaislamiento de proteína contaminante con el método de aislamiento de EV seleccionado, ya que el exosoma estándar (control positivo) solo identificó una banda mínima.

Figura 1 Caracterización de plasma EV usando los siguientes métodos: (A) Western blot del marcador de control negativo Albúmina y marcadores EV flotillina-1 y presencia o ausencia de CD9 en pacientes con EPOC exacerbada (EX) (n=2) y estable (ST) (n=2) (Pt), así como exosoma liofilizado estándar a partir de plasma (EXS STD) y plasma crudo (RAW). (B) Imágenes TEM representativas de campo amplio (panel izquierdo) y de primer plano (panel derecho) de vehículos eléctricos de plasma aislados de un paciente con EPOC durante un evento de exacerbación. La flecha roja indica vehículos eléctricos pequeños. Se incluyen barras de escala calibradas (5 µm, panel izquierdo y 500 nm, panel derecho) como referencia.

Los EV en plasma de un paciente con EPOC exacerbado se visualizaron mediante TEM (Figura 1B), con una imagen de campo amplio (5 µm) que representa una muestra muy concentrada. Una imagen de primer plano a 500 nm resalta la muestra muy concentrada, con múltiples partículas pequeñas de membrana lipídica homogénea presentes (una vesícula más clara está resaltada por la flecha roja), por debajo del rango de tamaño de 100 nm, lo que sugiere que estas pequeñas vesículas están dentro del tamaño del exosoma rango.

El perfil de miARN EV derivado de plasma identificó miARN significativamente desregulados representados de manera diferencial entre los participantes con EPOC exacerbada y aquellos en estado estable

El panel de PCR miRCURY LNA miRNA Serum/Plasma Focus de QIAGEN se utilizó para analizar 179 miRNAs específicos de suero y plasma humanos (incluidos los controles internos) en vehículos eléctricos derivados de plasma. Se visualiza un clustergram no supervisado de expresión de miARN en cada muestra de paciente (Figura 2). MiARN candidatos que podrían diferenciar entre 1) participantes con EPOC exacerbada (cohorte de prueba) y participantes en estado estable (cohorte de control) y 2) estadios GOLD (cohorte de control = GOLD 2 (moderado); cohorte de prueba = GOLD 3 (grave) y GOLD 4 (muy grave)) fueron identificados (Tabla 2).

Tabla 2 Desregulación de los objetivos de miARN que fueron significativamente diferentes entre las cohortes de EPOC en estado estable y exacerbado, así como las cohortes clasificadas como GOLD

Figura 2 Clustergram no supervisado que indica la magnitud de la expresión de miARN (verde = mínimo, rojo = máximo) en…