MiR-493-5p inhibe la diferenciación de células Th9 en el asma alérgica al dirigirse a FOXO1

El papel de los micro ARN (miARN) en el asma sigue sin estar claro. En este estudio, examinamos el papel de miRNA en la orientación de FOXO1 en el asma. Los resultados mostraron que miR-493-5p era uno de los miARN expresados ​​diferencialmente en las PBMC de niños asmáticos y también estaba asociado con la diferenciación de células Th. La expresión de miR-493-5p disminuyó significativamente en los ratones con asma inducida por OVA que en los grupos de control. El mimético miR-493-5p inhibió la expresión de IL-9, IRF4 y FOXO1, mientras que el inhibidor restauró estos efectos. Además, los resultados del análisis de luciferasa dual mostraron que FOXO1 es un nuevo objetivo válido de miR-493-5p. Según el experimento de rescate, miR-493-5p inhibió la diferenciación de células Th9 al dirigirse a FOXO1. Luego se identificaron los exosomas en asociación con la patogenia del asma. Varias células inflamatorias implicadas en los procesos asmáticos, incluidos los linfocitos B y T, las DC, los mastocitos y las células epiteliales, pueden liberar exosomas. Nuestros resultados demostraron que los exosomas derivados de DC pueden inhibir la diferenciación de células Th9 a través de miR-493-5p, por lo que miR-493-5p/FOXO1/Th9 exosomal derivado de DC puede servir como un objetivo terapéutico potencial en el desarrollo del asma.

El asma bronquial (abreviado como asma) es una de las enfermedades inflamatorias crónicas de las vías respiratorias más comunes y graves en los niños. En los últimos años, la incidencia y la mortalidad del asma han aumentado gradualmente en todo el mundo, lo que representa una gran amenaza para la salud de los niños y agrava la tensión financiera de las familias y la sociedad. El asma se ha convertido en un problema de salud pública mundial y ha suscitado gran preocupación. Desarrollar medidas de intervención a partir del nivel de patogenia del asma es el tratamiento clave, que es complicado y difícil de identificar.

Los estudios actuales sobre la patogenia del asma aún no están claros. La mayoría de los investigadores consideraron que la inhibición de las células T auxiliares tipo 1 (Th1) y la hiperfunción de las células T auxiliares tipo 2 (Th2) causaron el desequilibrio Th1/Th2 como la razón principal. Pero el desequilibrio Th1/Th2 no puede explicar todos los fenómenos experimentales del asma porque puede involucrar a otras poblaciones celulares. Con el descubrimiento de las células Th9, un nuevo subgrupo de CD4⁺Células Th, más estudios centrados en el papel de las células Th9 en la inmunopatología del asma demostraron que estas células se pueden diferenciar de las células Naïve CD4⁺Células T estimuladas por IL-4 y TGF-β, produciendo una gran cantidad de IL-9 [1]que se informa que Th9/IL-9 es patógeno en el asma [2, 3]. Además, se detectaron cambios significativos de varias citocinas relacionadas con la diferenciación de células Th9 en el modelo de asma en ratones en comparación con el grupo de ratones de control, incluida la caja forkhead O1 (FOXO1), IL-4, IL-9, IRF4, Spi1, BATF e IRF1. [2, 4](archivo adicional 1: Figura S1). Por lo tanto, la inhibición de la diferenciación de las células Th9 podría ser una potencial inmunoterapia para el asma.

Los miARN son ARN no codificantes cortos bien conocidos que regulan la expresión génica mediante el apareamiento de bases complementarias con la región 3′ no traducida (3’UTR) de los ARNm [5]. Hay una tendencia creciente de estudios centrados en miRNAs debido a su efecto funcional sobre la polarización de CD4⁺células T A través de la secuenciación de alto rendimiento, descubrimos que había muchos cambios anormales de miARN en las PBMC de niños asmáticos en comparación con los no asmáticos. Un análisis adicional de la ontología génica (GO) y el análisis de la vía de señalización de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) mostraron que una importante regulación negativa de las PBMC de los niños asmáticos estaba relacionada con la diferenciación de las células T. Además, se informó que el factor de transcripción FOXO1 es un regulador positivo de la diferenciación de células Th9 al unirse a los promotores de IL-9 e IRF4. [6]. Por lo tanto, FOXO1 se consideró como un posible gen diana de miR-493-5p de TargetScan.

Los investigadores también estudiaron la patogenia del asma en asociación con los exosomas [12]. Los exosomas son pequeñas vesículas (30 a 100 nm) que permiten la comunicación celular al transportar diferentes moléculas, como ácidos nucleicos, lípidos y proteínas, y se han considerado mensajeros eficientes de célula a célula que pueden cruzar barreras biológicas y modular el sistema inmunitario. [7,8,9,10,11]. Varias células inflamatorias implicadas en los procesos asmáticos, incluidos los linfocitos B y T, las DC, los mastocitos y las células epiteliales, pueden liberar exosomas. [12]. Los exosomas de las CD contienen moléculas y estimularán las respuestas de las células T [13]. Por lo tanto, investigamos el efecto de miR-493-5p en el papel de la diferenciación de células Th9 al dirigirse a FOXO1. Nuestros resultados demostraron que miR-493-5p exosomal derivado de DC podría inhibir la diferenciación de células Th9 al dirigirse a FOXO1.

Datos de asma infantil

Pacientes diagnosticados de asma según las guías de la Global Initiative for Asthma [14] se inscribieron en el departamento de medicina pulmonar del Hospital Infantil de la Universidad de Soochow. Los sujetos sanos no atópicos se incluyeron como grupo control. Se utilizaron muestras de sangre periférica de 5 pacientes con exacerbación de asma y 5 niños sanos para la secuenciación de alto rendimiento. Todos los sujetos recibieron instrucciones de evitar el uso de medicamentos para el asma (como glucocorticoides) 4 semanas antes de la prueba. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética local del Hospital de Niños de la Universidad de Soochow. Todos los participantes habían firmado el consentimiento informado.

Experimento de asma en ratones

Para desarrollar el modelo de asma inducida por OVA, ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad (peso 20 ± 2 g) se dividieron en cuatro grupos de acuerdo con la demanda experimental (n = 8). Se disolvieron 2 mg de OVA (Sigma, SLBP0782V) con 4 ml de PBS que contenía 40 mg de hidróxido de aluminio (Sinopharm) y se inyectaron 100 μl de la mezcla en la cavidad abdominal de los ratones experimentales el día 0 y el día 7. A continuación, se los ratones se trataron con OVA por inhalación (5%) durante 30 min por día desde el día 17 hasta el día 20 para construir el modelo de asma. Tres días antes de la exposición, se administraron 50 μl (10 nmol) de miR-493-5p agomiR o 50 μl de agomiR NC mediante gotas nasales durante 3 días. Los ratones de los grupos de control se trataron con PBS. El experimento con animales ha sido aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Suzhou (No. SUDA20210512A01). El proceso de prueba siguió el principio de las 3R (Reducción, Reemplazo, Refinamiento).

Medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias

Los ratones fueron anestesiados para la medición de la mecánica pulmonar 24 h después del último desafío con OVA. Los ratones fueron anestesiados con 50 mg/kg de pentobarbital e instrumentados para la medición de la mecánica pulmonar (BUXCO Electronics), luego fueron traqueostomizados, intubados y ventilados mecánicamente a un volumen tidal de 0,2 ml y una frecuencia de 150 respiraciones/min. La resistencia pulmonar (RL) se midió en respuesta a dosis crecientes (3 a 20 mg/ml) de metacolina de cloruro de acetil-β-metilcolina en aerosol (Sigma-Aldrich).

Muestras de pulmón de ratones

Después de la medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias, los ratones fueron sometidos a eutanasia por dislocación de la columna cervical, luego colocaron al ratón sobre una superficie de disección con el lado ventral hacia arriba. Limpie toda la superficie ventral del ratón con toallitas de alcohol estériles saturadas con isopropanol al 70% para desinfectar. Monte el ratón con las cuatro patas sujetas. Se expuso la tráquea y se usaron 0,5 ml de PBS durante 3 lavados consecutivos para obtener BALF. Abra suavemente la cavidad torácica incidiendo lentamente la caja torácica a través del mediastino, los tejidos del pulmón izquierdo se fijaron en formalina tamponada neutra al 10% (48 h) y se incluyeron en la fijación de parafina. Luego, las secciones incluidas en parafina se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E), ácido peryódico de Schiff (PAS) para evaluar la inflamación pulmonar. Los tejidos pulmonares restantes se analizaron mediante citometría de flujo, Western Blot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR).

Aislamiento de células de pulmón de ratón

Los pulmones perfundidos se transfirieron a una placa de cultivo de 60 mm estéril y libre de pirógenos con 3 ml de PBS. Pulmón…