Nuevas variantes de alfa-1-antitripsina: simulaciones estructurales y expresión clínica

Fondo

La deficiencia de alfa-1 antitripsina (AATD) se caracteriza por niveles séricos reducidos de la proteína AAT y predispone a enfermedades hepáticas y pulmonares. La caracterización a nivel estructural de nuevos mutantes patogénicos de SERPINA1 que codifican AAT circulante podría proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos del mal plegamiento de AAT. El presente estudio tuvo como objetivo proporcionar un marco práctico para la identificación y el análisis de nuevas mutaciones AAT, combinando simulaciones estructurales y datos clínicos.

Métodos

Analizamos un total de cinco mutaciones (cuatro no descritas previamente) en un total de seis sujetos que presentaban DAAT de moderada a grave: Gly95Alafs*18, Val210Glu, Asn247Ser, Pi*S + Asp341His y Pi*S + Leu383Phe + Lys394Ile. Se desarrollaron y combinaron datos clínicos, ensayos de genotipado y fenotipado, mapeo estructural y caracterización conformacional a través de simulaciones de dinámica molecular (MD).

Resultados

Las variantes sin sentido de AAT recién descubiertas se localizaron tanto en la superficie de interacción como en el núcleo hidrofóbico de la proteína. La distribución de mutaciones a lo largo de la estructura reveló Val210Glu en la hebra s4C expuesta al solvente y cerca de la región “Puerta”. Asn247Ser se ubicó en la superficie accesible, lo cual es importante para la unión de glicanos. Por otro lado, Asp341His, Leu383Phe se mapearon cerca de las regiones de “brecha” y “obturador”. El análisis MD reveló la remodelación de las interacciones locales en torno a las sustituciones investigadas que tienen efectos variables en la flexibilidad conformacional de AAT, el empaque hidrofóbico y las propiedades de la superficie electrónica. Los cambios estructurales más severos se observaron en los modelos moleculares de doble y triple mutante (Pi*S + Asp341His y Pi*S + Leu383Phe + Lys394Ile). Los dos portadores presentaban alteración de la función pulmonar.

Conclusiones

Los resultados caracterizan cinco variantes, cuatro de ellas previamente desconocidas, del SERPINA1 gen, que definen nuevos alelos que contribuyen a la deficiencia de AAT. Las variantes raras pueden ser más frecuentes de lo esperado y, por lo tanto, en casos discordantes, la detección estandarizada de los alelos S y Z necesita complementarse con secuenciación de genes y enfoques estructurales. Se discute la utilidad del modelado computacional para proporcionar evidencia de respaldo de la patogenicidad de variaciones raras de un solo nucleótido.

Un factor de riesgo genético conocido para la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es la deficiencia grave de alfa-1 antitripsina (AATD), un trastorno autosómico co-dominante hereditario [1]. AATD se caracteriza por niveles séricos reducidos de la proteína alfa-1 antitripsina (AAT) y predispone a enfermedades hepáticas y pulmonares. [2]. La AAT es sintetizada en niveles elevados por los hepatocitos y en concentraciones más bajas por las células epiteliales intestinales, los neutrófilos, las células epiteliales pulmonares y los macrófagos alveolares. [3]. Es una importante proteína de fase aguda y el principal inhibidor de la serina proteasa en el suero humano, en el que muestra una fuerte afinidad por la elastasa de los neutrófilos. El sitio principal de actividad de AAT está en el pulmón, protegiendo el frágil tejido conectivo del tracto respiratorio inferior de la proteólisis descontrolada provocada por los neutrófilos durante la inflamación. Es importante destacar que la AAT también se ha convertido en una proteína multifuncional que combina sus propiedades inhibidoras con actividades inmunomoduladoras y antiinflamatorias. [4].

AAT está codificada por el altamente polimórfico SERPINA1 gen, que se encuentra en el cromosoma 14q32.1 y comprende cuatro exones codificantes (II-V), tres exones no traducidos (Ia-Ic) y seis intrones [5]. La AAT nativa comprende 418 aminoácidos, de los cuales los 24 aminoácidos iniciales son un péptido señal y se eliminan posteriormente. Esto da como resultado una proteína madura de 394 aminoácidos de 52 kDa que normalmente está glicosilada en los residuos Asn46, Asn83 y Asn247. [6, 7]. La estructura terciaria de AAT consta de 3 láminas β (A–C), 9 hélices α (A–I) y un bucle central reactivo (RCL), que es una región importante para la interacción inicial con la proteasa objetivo. [8]. Esta proteína se caracteriza por un pliegue nativo metaestable que es particularmente sensible a las mutaciones. [9, 10]. Sustituciones de un solo aminoácido en posiciones específicas de SERPINA1 podría favorecer la transición a pliegues disfuncionales poliméricos o inactivos ligados a la enfermedad [11, 12].

más de 150 SERPINA1 Hasta la fecha se han identificado mutaciones y, de ellas, 60 están implicadas en la patogenia de la enfermedad. [13, 14]. El alelo normal y no causante de enfermedad de AAT se llama Pi*M y está presente en más del 90% de la población. Los alelos deficientes más frecuentes son Pi*S (Glu264Val) y Pi*Z (Glu342Lys) [15, 16]. En particular, los portadores de dos alelos Z (Pi*ZZ) tienen concentraciones circulantes muy reducidas de AAT (hasta 10 a 20% de lo normal, que es de 1.3 a 2 g/L). Otros alelos raros de AAT también están asociados con concentraciones séricas reducidas de la proteína AAT, como Pi*Mmalton (Phe52del) y Pi*Siiyama (Ser53Phe), que también forman polímeros intracelulares. [17,18,19]. Si bien el descubrimiento de variantes raras aumenta continuamente, especialmente en personas con concentraciones más bajas de AAT, la mayoría sigue sin tener un significado clínico desconocido. [20, 21].

La caracterización in vitro para definir la patogenicidad de todas las mutaciones AAT identificadas es poco probable que se realice en algunos laboratorios de diagnóstico. [22]. Sin embargo, el modelado computacional ha demostrado ser una herramienta útil para caracterizar los posibles efectos nocivos de estas variantes aún no caracterizadas y proporcionar un diagnóstico más preciso. En este sentido, la combinación de técnicas experimentales y computacionales ha resultado útil para estudiar la influencia de las sustituciones de aminoácidos en la estructura y función de proteínas mutadas a través de varios ejemplos. [23]. Así, la caracterización a nivel estructural de nuevos patógenos SERPINA1 Las mutaciones que codifican la AAT circulante podrían proporcionar una nueva visión de los mecanismos del plegamiento incorrecto de la AAT en las enfermedades hepáticas y pulmonares, con implicaciones importantes para el diagnóstico molecular y el desarrollo terapéutico. [24, 25].

El presente estudio tuvo como objetivo proporcionar un marco práctico para la identificación y el análisis de nuevas mutaciones AAT en un contexto clínico, combinando datos clínicos, ensayos de genotipado y fenotipado, mapeo estructural y simulaciones de dinámica molecular (MD). Usando este enfoque, describimos seis nuevas variantes de AAT no caracterizadas y delineamos su papel potencial en la dinámica conformacional de este inhibidor de la proteasa.

Asignaturas

Todos los pacientes fueron reclutados de la consulta externa del servicio respiratorio del Hospital Universitario Vall d’Hebron (Barcelona, ​​España) [26]. Fueron identificados siguiendo el algoritmo de diagnóstico de DAAT utilizado en nuestro laboratorio, que comprende tres estrategias: cuantificación de AAT en suero, fenotipado de proteínas y genotipado [27].

Análisis mediante la secuenciación de toda la región de codificación de la SERPINA1 El gen se lleva a cabo en pacientes con discrepancias entre la concentración de AAT y el patrón fenotípico o el genotipo específico de alelo. Identificamos seis portadores de cinco variantes (cuatro no descritas previamente): Gly95Alafs*18 en el paciente 1, Val210Glu en los pacientes 2 y 3, Asn247Ser en el paciente 4, Pi*S + Asp341His en el paciente 5 y Pi*S + Leu383Phe + Lys394Ile en el paciente 6.

El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Vall d’Hebron (Barcelona, ​​España) con el número PR(AG) 157/2016, y se obtuvo el consentimiento informado firmado de todos los sujetos para participar en el estudio.

Análisis clínicos y moleculares

Datos clínicos y pruebas de laboratorio

Se recogieron las características clínicas y datos de la función pulmonar (volumen espiratorio forzado en el 1.er segundo (FEV1), capacidad vital forzada (FVC) y cociente FEV1/FVC). La función hepática se determinó mediante el análisis de las enzimas hepáticas: aspartato-aminotransferasa (AST), alanina-aminotransferasa (ALT) y gamma-glutamil transferasa (GGT). Además, se realizó una prueba mejorada de fibrosis hepática (ELF)…