Papel de los mastocitos en la patogénesis del daño pulmonar severo en pacientes con COVID-19

Antecedentes

Todavía hay conocimiento insuficiente con respecto a la posible participación de los mastocitos (MC) y sus mediadores en la patología de la enfermedad por coronavirus-2019 (COVID-19). Por lo tanto, nuestro estudio tuvo como objetivo investigar el papel de los MC, su activación y los perfiles de proteasa en la patogenia del daño pulmonar temprano y tardío en pacientes con COVID-19.

Métodos

Se utilizaron muestras de pulmón fijadas en formalina e incluidas en parafina de 30 pacientes que murieron a causa de COVID-19 y 9 controles para la detección histológica de MC y sus proteasas (triptasa, quimasa) seguido de cuantificación morfométrica.

Resultados

Nuestros resultados demostraron un mayor número de MC en la etapa inicial y un mayor aumento del número de MC durante la última etapa del daño alveolar en pacientes con COVID-19, en comparación con el grupo de control. Es importante destacar que el porcentaje de MC desgranuladas (activadas) fue mayor durante ambas etapas de las lesiones alveolares en comparación con los controles. Si bien no hubo una alteración destacada en el perfil de los MC positivos para triptasa, nuestros datos revelaron una elevación significativa en la cantidad de MC positivos para quimasa en los pulmones de pacientes con COVID-19, en comparación con los controles.

Conclusiones

Los MC se caracterizan por una acumulación desregulada y una mayor activación en los pulmones de pacientes que padecen COVID-19. Sin embargo, se necesitan futuros estudios profundos para un análisis preciso del papel de estas células inmunitarias en el contexto de la nueva enfermedad por coronavirus.

Nuestros datos arrojan más luz sobre el problema clínico de la inflamación pulmonar desregulada, con un enfoque particular en los mastocitos, en el contexto de COVID-19. Esto puede proporcionar una vía para el desarrollo futuro de la terapia dirigida contra los mastocitos hiperactivados para tratar a los pacientes con COVID-19.

La enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) es una nueva enfermedad infecciosa cuyas manifestaciones clínicas van desde asintomáticas hasta un síndrome respiratorio agudo severo con daño generalizado del tejido pulmonar que puede causar la mortalidad por esta enfermedad. La COVID-19 grave provoca daño alveolar difuso acompañado del síndrome alveolar-hemorrágico y trombosis generalizada de la microvasculatura que conduce a hipoxia e insuficiencia respiratoria [1, 2]. Se cree que la patología pulmonar en COVID-19 es inmunomediada y exacerbada por la infiltración de monocitos, neutrófilos y subpoblaciones de linfocitos T [3]. Se ha identificado una tormenta de citocinas que causa una mortalidad mucho mayor que cualquier citotoxicidad viral directa en aproximadamente el 15-20 % de los pacientes que padecen COVID-19 con daño pulmonar grave [4]. La tormenta de citocinas asociada a la COVID-19 se caracteriza por una rápida proliferación e hiperactivación del enlace de células T, macrófagos y células asesinas naturales, así como una mayor producción de citocinas y quimiocinas inflamatorias liberadas por células inmunitarias o no inmunitarias [2, 5,6,7,8]. Una de las fuentes de tales citocinas y quimiocinas son los mastocitos (MC), que se encuentran en todas partes del cuerpo, especialmente en los órganos del sistema respiratorio, y son cruciales en el desarrollo de una serie de condiciones patológicas. [7, 9, 10].

Las MC son un grupo ubicuo de células de linaje mieloide estratégicamente localizadas en áreas funcionalmente significativas del cuerpo, incluida la piel, el sistema respiratorio, la mucosa gastrointestinal, para una interacción funcional óptima con células inmunocompetentes y del estroma, así como con estructuras extracelulares de un tejido específico. microambiente. Las MC están representadas por una población celular muy heterogénea con diferencias dependientes del subtipo en morfología, propiedades histoquímicas, expresión de proteasa y función. Los MC tienen amplias propiedades multifuncionales asociadas con la liberación de muchos mediadores preformados, fagocitosis, procesamiento de antígenos, producción de citoquinas, etc. [11, 12]. También pueden reclutar células inmunitarias en el foco de la inflamación, secretando quimiocinas y otros mediadores que pueden aumentar localmente la permeabilidad vascular. [12]. La histamina liberada por los MC en combinación con la interleucina (IL)-1 puede causar un aumento de la inflamación pulmonar como resultado de la infección viral del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) [13]. Ciertos mediadores derivados de las MC, las proteasas, como las β-triptasas, las quimasas y la carboxipeptidasa A (CPA)-3, se consideran específicos de las MC e indican el estado de su activación. [12, 14]. La funcionalidad de las serina proteasas, especialmente triptasas y quimasas, ha despertado el interés por estudiar los efectos reguladores en el curso de la infección por coronavirus. Por ejemplo, se sabe que la quimasa participa en la hidrólisis activa de angiotensina I a angiotensina II, por lo que es un participante potencial en el desarrollo de insuficiencia cardíaca e hipertensión pulmonar. [15].

Es importante destacar que los científicos de muchos países están estudiando activamente la patomorfología de las lesiones pulmonares en COVID-19, pero solo unos pocos estudios se dedican al papel de las MC en la patogénesis de la enfermedad. Por lo tanto, el objetivo de nuestro estudio fue evaluar el perfil de proteasa de las MC y el papel de su activación en la patogénesis del daño pulmonar temprano y tardío en el contexto de la nueva infección por coronavirus.

Este estudio morfológico se llevó a cabo sobre la base de los materiales de 39 autopsias de los pulmones en la “Oficina Patológica Regional de Voronezh” y fue aprobado por el comité de ética local de la Universidad Médica Estatal de Burdenko Voronezh (protocolo n.º 8, 17 de septiembre de 2021). Estudiamos especímenes pulmonares de autopsia de 30 pacientes que fallecieron por COVID-19 y de 9 pacientes que fallecieron por accidente o que fallecieron por otras enfermedades en las que los pulmones no estaban patológicamente afectados (grupo control). Este estudio retrospectivo incluyó material solo de aquellos pacientes cuyos cuerpos no fueron reclamados por sus familiares después de la muerte (cadáveres no reclamados) y fueron sometidos a entierro municipal.

Después del muestreo durante la autopsia y la fijación en formalina tamponada neutra al 10 %, se llevó a cabo la inclusión en parafina de acuerdo con el procedimiento estándar de preparación de muestras. [16]. A partir de bloques de parafina, se utilizaron secciones preparadas con un espesor de 5 μm para la tinción con hematoxilina y eosina, colorante de Giemsa y picro Mallory. Para el análisis inmunohistoquímico se prepararon cortes ultrafinos de 2 µm de espesor. La tinción inmunohistoquímica se realizó de acuerdo con el protocolo estándar [16], detectando proteasas MC—triptasa y quimasa y evaluando la proliferación de alveolocitos tipo II por expresión de PCNA. La identificación de las proteasas se llevó a cabo utilizando los anticuerpos primarios de ratón Anti-Mast Cell Triptasa (clon AA1, #ab2378, dilución 1:4000) y Anti-Mast Cell Chymase (#ab233103, dilución 1:1000), proteína nuclear PCNA se detectó usando inmunomarcaje con anticuerpos monoclonales primarios de conejo Anticuerpo anti-PCNA (Epitomics #AC-0087RUO, clon EP91, dilución 1:1000, EE. UU.). Como anticuerpos secundarios se utilizaron anticuerpos de cabra anti-conejo y anti-ratón #AS-R1-HRP, los cuales, a su vez, se visualizaron con ImmPACTTM DAB Peroxidase Substrat Kit (#SK-4105) de acuerdo al protocolo especificado en las instrucciones. Los núcleos se contrastaron con hematoxilina de Mayer, después de lo cual los cortes se colocaron en el medio de montaje. El estado de activación de MC se evaluó mediante la representación cuantitativa de mastocitos positivos para triptasa y quimasa. [9,10,11].

Las micropreparaciones teñidas se estudiaron en un microscopio ZEISS Axio Imager.A2 con un sistema de documentación fotográfica equipado con una cámara digital en color Camera Axiocam 506. Las imágenes se procesaron con el software ZEN 2.3 (Carl Zeiss, Alemania). El número total de MC se contó en la lente × 40 con el análisis de al menos 50 campos de visión. El análisis planimétrico de las micropreparaciones incluyó el recuento de MC teñidas metacromáticamente con colorante Giemsa, seguido de la distribución funcional según el grado de desgranulación y el análisis cuantitativo del perfil de proteasas (triptasa, quimasa) por…