Resumen
Fondo
Los bebés prematuros, sometidos a oxígeno suplementario y ventilación mecánica, pueden desarrollar displasia broncopulmonar, una enfermedad pulmonar crónica caracterizada por displasia alveolar y vascularización alterada. Nosotros y otros hemos demostrado que la hiperoxia provoca senescencia en células epiteliales de pulmón cultivadas y fibroblastos. Aunque miR-34a modula la senescencia, no está claro si contribuye a la senescencia inducida por hiperoxia. Presumimos que la hiperoxia aumenta los niveles de miR-34a, lo que lleva a la senescencia celular.
Métodos
Expusimos células epiteliales de pulmón de ratón (MLE-12) y células epiteliales primarias de vías respiratorias pequeñas humanas a hiperoxia (95% O2/5% CO2) o aire (21% O2/5% CO2) durante 24 horas. Se expuso a ratones recién nacidos (< 12 h de edad) a hiperoxia (> 95% O2) durante 3 días y se permitió que se recuperara en el aire de la habitación hasta el día 7 después del nacimiento. Se emplearon muestras de pulmón de bebés humanos prematuros que requerían ventilación mecánica y sujetos de control que no recibieron ventilación mecánica.
Resultados
La hiperoxia causó la senescencia como lo indica la pérdida de la lámina nuclear B1, el aumento de la expresión del gen p21 y los factores fenotípicos secretores asociados a la senescencia. La expresión de miR-34a-5p aumentó en células epiteliales y ratones recién nacidos expuestos a hiperoxia, y en bebés prematuros que requerían ventilación mecánica. La transfección con un inhibidor de miR-34a-5p redujo la senescencia inducida por hiperoxia en células MLE-12. Además, la hiperoxia aumentó los niveles de proteína del oncogén y el factor 4 similar a Krüppel supresor de tumores (KLF4), que fueron inhibidos por un inhibidor de miR-34a-5p. Además, la eliminación de KLF4 por transfección de siRNA redujo la senescencia inducida por hiperoxia.
Conclusión
La hiperoxia aumenta miR-34a-5p, lo que lleva a la senescencia en las células epiteliales del pulmón. Esto está dictado en parte por la regulación positiva de la señalización de KLF4. Por lo tanto, la inhibición de la senescencia inducida por hiperoxia a través de la supresión de miR-34a-5p o KLF4 puede proporcionar una nueva estrategia terapéutica para mitigar las consecuencias perjudiciales de la hiperoxia en el pulmón neonatal.
Introducción
La displasia broncopulmonar (DBP) es la enfermedad pulmonar crónica más común en los bebés prematuros. La mayoría de los bebés prematuros pueden sobrevivir gracias a los avances médicos [1]. Sin embargo, la prevalencia de la DBP está aumentando, muy probablemente debido a la mayor supervivencia de los recién nacidos con una edad gestacional extremadamente baja. La displasia broncopulmonar aumenta el riesgo de morbilidad pulmonar y resultados adversos del desarrollo neurológico [2,3,4,5]. Los factores de riesgo de la displasia broncopulmonar son complejos e incluyen inflamación, deficiencia de surfactante, ventilación y toxicidad por oxígeno. [6]. Una característica fisiopatológica clave de la DBP es la displasia alveolar y el deterioro de la vascularización junto con respuestas inflamatorias y fibrogénesis. [7].
El perfil de expresión genómica amplia mediante micromatrices de ADN ha identificado recientemente nuevos genes y vías relacionados con la displasia broncopulmonar. [8, 9]. Un enfoque complementario para perfilar la expresión génica en BPD es analizar firmas de expresión de microARN (miARN, miR) [10, 11]. Estos miARN son ARN no codificantes de 21 a 24 nucleótidos que regulan la expresión génica a través de la represión postranscripcional al unirse a la región 3′ no traducida (3′-UTR) del ARNm del gen objetivo o la traducción del ARNm al inicio, después del inicio y pasos de elongación [12]. Desempeñan un papel importante en la modulación de la diferenciación celular, la proliferación, la inflamación, la muerte celular y la senescencia. [13,14,15,16]. Estudios recientes respaldan la hipótesis de que la desregulación de múltiples proteínas por parte de los miARN contribuye a la patogenia de la DBP [17,18,19]. Por lo tanto, los miARN se han considerado como candidatos prometedores para nuevos enfoques terapéuticos dirigidos al TLP.
La senescencia es una respuesta protectora al estrés en la que las células adquieren un estado no proliferativo y desarrollan un fenotipo secretor asociado a la senescencia proinflamatorio (SASP) que media los efectos paracrinos [20]. La respuesta de la senescencia provoca cambios sorprendentes en el fenotipo celular, incluida una detención permanente de la proliferación celular, el desarrollo de resistencia a la apoptosis y un patrón alterado de expresión génica. [21]. Las señales que inducen la senescencia generalmente involucran las vías p53-p21 o p16-proteína de retinoblastoma (pRB). La senescencia del desarrollo, que permite la remodelación de tejidos y la diferenciación de órganos, está regulada por p21 [22]. Por el contrario, la senescencia inducida por el estrés ocurre después del daño al ADN de doble cadena a través de especies reactivas de oxígeno. Este tipo de senescencia suele estar mediada por p53 y pRB, pero también es específica del estrés. [23]. Se ha demostrado que la proteína p21 inhibe la proliferación celular, lo que induce la senescencia celular para permitir que las células reparen el ADN dañado. [24, 25]. Un estudio anterior, utilizando un modelo de ratón, informó que una alta concentración de oxígeno (hiperoxia) induce el crecimiento pulmonar y la detención del ciclo celular y aumenta la expresión de p21 [26]. Nosotros y otros hemos demostrado que la hiperoxia causa senescencia en células epiteliales pulmonares cultivadas, fibroblastos y células musculares lisas. [27,28,29]. Los mecanismos subyacentes a la senescencia inducida por hiperoxia no se comprenden completamente.
Nosotros y otros hemos demostrado que miR-34a fue la especie de miARN de pulmón con mayor aumento utilizando una matriz de miARN en un modelo de ratón de BPD [18, 30]. Además, se ha informado un aumento de la expresión de miR-34a en células aisladas de aspirado traqueal de recién nacidos que posteriormente desarrollaron DBP, en la primera semana posnatal. [19] y que el aumento de miR-34a-5p pulmonar alteró la angiogénesis endotelial en ratones recién nacidos expuestos a hiperoxia [19]. La mayoría de los miARN modulan la senescencia regulando directa o indirectamente las vías p53/p21 o p16/pRB [14]. Además, estudios previos muestran que puede haber dos bucles de retroalimentación positiva entre los genes diana p53, miR-34a y miR-34a durante la senescencia. [14, 31,32,33]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la hiperoxia causa senescencia en las células epiteliales pulmonares mediante la regulación positiva de miR-34a.
materiales y métodos
Cultivo de células
Se adquirieron células epiteliales de pulmón de ratón (MLE-12) y células epiteliales de vías respiratorias pequeñas humanas (SAEC) de ATCC (CRL-2110, Manassas, VA, EE. UU.) y Lonza (CC-2547, Basilea, Suiza), respectivamente. Las células MLE-12 se mantuvieron con 5% de CO2, a 37 ℃, en medio DMEM/F12 que contiene FBS al 2 %, insulina (5 µg/ml), transferrina (10 µg/ml), selenito de sodio (30 nM), hidrocortisona (10 nM), β-estradiol (10 nM ), HEPES (10 nM), glutamina (2 mM) y P/S al 1 % (100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina). Los SAEC se mantuvieron con 5% de CO2a 37 ℃, en SABM Basal Medium (CC-3119, Lonza) y suplementos SAGM SingleQuots (CC-4124, Lonza) que contienen extracto de pituitaria bovina, insulina, hidrocortisona, gentamicina/anfotericina-B, ácido retinoico, bovino libre de ácidos grasos albúmina sérica (BSA), transferrina, triyodotironina, epinefrina y factor de crecimiento epidérmico humano.
exposición hiperóxica
Las células con una confluencia del 70% al 80% se expusieron a hiperoxia (95% O2 y 5% CO2) o aire (21% O2 y 5% CO2) durante 24 horas. Los medios de cultivo se cambiaron cada 24 h. Ratones C57BL/6J recién nacidos (< 12 h de edad) junto con su madre fueron expuestos al aire ambiente o hiperoxia (> 95% O2) durante 72 h en una cámara A (BioSpherix). Las madres se cambiaron cada 24 h entre aire ambiente e hiperoxia para evitar lesiones pulmonares. Se permitió que algunos cachorros se recuperaran al aire libre hasta el día postnatal (pnd) 7.
Tejidos pulmonares de bebés prematuros
Se obtuvieron muestras de pulmón humano de bebés prematuros entre 23 y 29 semanas de edad posmenstrual, que vivieron de 5 a 15 días y requirieron ventilación mecánica (a corto plazo), y los controles fueron bebés prematuros que no recibieron ventilación mecánica y sobrevivieron menos de 24 h. . Los datos clínicos de estos lactantes se muestran en la Tabla 1. Estas muestras fueron descritas en nuestro informe anterior. [34].
Tinción de inmunofluorescencia
Las células se fijaron en formalina tamponada neutra al 10 % (n.º 245–684, ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE, EE. UU.) durante 15 min, seguido de permeabilización con Tween-20 al 0,2 % (BP337, Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. 15 min en la habitación…
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