Perfiles de expresión génica en células estromales mesenquimales de médula ósea, tejido adiposo y tejido pulmonar de pacientes con EPOC y controles

Fondo

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por un daño irreversible del tejido pulmonar. Se esperan con urgencia nuevas estrategias regenerativas. Las células madre/estromales mesenquimales cultivadas (MSC) han mostrado resultados prometedores en modelos experimentales de EPOC, pero las diferencias entre las fuentes pueden afectar su uso potencial en estrategias terapéuticas en pacientes.

Apuntar

Evaluar el transcriptoma de MSC derivadas de pulmón (LMSC), MSC derivadas de médula ósea (BM-MSC) y MSC derivadas de tejido adiposo (AD-MSC) de pacientes con EPOC y controles sin EPOC.

Métodos

Estudiamos las diferencias en los perfiles de expresión génica entre los subtipos de MSC, así como entre la EPOC y el control mediante secuenciación de ARN (RNA-seq).

Resultados

Mostramos que además de la heterogeneidad entre los donantes, las MSC de diferentes fuentes tienen firmas genéticas fuertemente divergentes. Los factores de crecimiento FGF10 y HGF se expresaron predominantemente en LMSC. Las MSC de todas las fuentes mostraron perfiles de expresión alterados en la EPOC, con genes regulados al alza y a la baja significativamente más pronunciados en las MSC del tejido adiposo. El análisis de la ruta reveló que los genes expresados ​​de manera más diferencial en las AD-MSC derivadas de la EPOC están involucrados en la unión y expresión de la matriz extracelular (ECM). En LMSC, el gen que difería más fuertemente entre la EPOC y el control fue CSGALNACT1un gen modulador de ECM.

Conclusión

Las MSC autólogas de pacientes con EPOC muestran anomalías con respecto a su transcriptoma, que sorprendentemente fueron más profundas en las MSC de fuentes extrapulmonares. Las LMSC pueden estar óptimamente equipadas para la reparación del tejido pulmonar debido a la expresión de genes específicos del factor de crecimiento.

La Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica, según la OMS la tercera causa de muerte en el mundo [1]. Los principales factores de riesgo de la EPOC incluyen la inhalación de partículas nocivas, como el humo del cigarrillo y los contaminantes del aire, que provocan una inflamación crónica en los pulmones, daños en el tejido pulmonar y reparación anómala del tejido en pacientes con EPOC. La enfermedad se caracteriza por un exceso de secreción de moco (bronquitis crónica), engrosamiento de la pared de las vías respiratorias (pequeñas) y destrucción de los alvéolos (enfisema), lo que conduce a una limitación del flujo de aire y una disminución acelerada de la función pulmonar. La pérdida de tabiques alveolares es irreversible y no puede ser tratada con las terapias actuales. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevas estrategias de tratamiento para combatir la pérdida progresiva de la función pulmonar mediante el refuerzo de los mecanismos de reparación alveolar, incluidos los enfoques de medicina regenerativa.

Las estrategias basadas en células han mostrado resultados prometedores en enfermedades inmunomediadas y en modelos experimentales de EPOC y enfisema [2, 3]. La población de células madre más utilizada para aplicaciones terapéuticas en estudios preclínicos y clínicos es la célula madre/estromal mesenquimal (MSC). Las MSC son células madre multipotentes que pueden derivarse de varios tejidos del estroma, incluidos la médula ósea, el tejido adiposo y los pulmones. [4]. Los efectos beneficiosos de las MSC se han atribuido principalmente a los mecanismos paracrinos, que secretan factores de crecimiento regenerativos, así como factores antiinflamatorios/inmunosupresores. [3]. Su uso ha sido ampliamente evaluado para mejorar la función pulmonar en modelos animales de enfisema, lo que reduce la inflamación mientras ayuda a reparar el daño alveolar y restaura la estructura pulmonar. [2]. Sin embargo, mientras que los ensayos clínicos en humanos demostraron la seguridad de la terapia, el tratamiento con MSC autólogas derivadas de la médula ósea (BM-MSC) aún no ha dado como resultado la restauración de la estructura alveolar ni efectos beneficiosos sobre la función pulmonar. [5]. Esto puede deberse a una variedad de factores, incluida la falta de conocimiento sobre la vía óptima de administración, la dosificación, la fuente, el momento y la frecuencia del tratamiento y la retención limitada de MSC. Se desconoce si las BM-MSC administradas por vía intravenosa están equipadas para injertarse y sobrevivir en el tejido pulmonar. De hecho, debido a la falta de estandarización de los protocolos y al conocimiento limitado sobre las propiedades de las MSC residentes en los pulmones, se desconoce qué fuente de MSC es adecuada para lograr efectos regenerativos en los pulmones. Si bien las MSC de diferentes fuentes comparten características comunes, como la secreción de factores regenerativos y antiinflamatorios, los perfiles de expresión pueden diferir. Informes anteriores han mostrado diferencias en la efectividad de las MSC de diferentes tipos de tejido para reducir las manifestaciones de la EPOC en modelos animales. Por ejemplo, al comparar la eficacia de las MSC derivadas de pulmón (LMSC) y BM-MSC, las células de ambas fuentes mejoraron el daño pulmonar, aunque las LMSC mostraron una mayor expresión de moléculas de adhesión endotelial específicas y una mayor retención en los pulmones. [6]. En un estudio que comparó las LMSC, las BM-MSC y las MSC derivadas de tejido adiposo (AD-MSC), las BM-MSC mostraron los efectos sistémicos beneficiosos más pronunciados, mientras que las AD-MSC y las LMSC lograron una reducción más significativa en el área fraccional de colapso alveolar. [4].

Uno de los desafíos del uso de MSC autólogas puede ser que las células aisladas de un microambiente enfermo, con inflamación crónica, una alta carga de estrés oxidativo y destrucción extensa de tejido, pueden mostrar deficiencias en su capacidad regenerativa. Dado que la EPOC es una enfermedad sistémica que a menudo se acompaña de anomalías metabólicas, las células de los tejidos extrapulmonares también pueden verse afectadas. Debido a la alta plasticidad de las MSC, sus funciones pueden cambiar adicionalmente en el cultivo in vitro. Por lo tanto, es particularmente relevante comparar las MSC que se han cultivado exactamente de la misma manera.

Juntos, además del perfil de las MSC del pulmón, las preguntas que quedan son si las MSC de los pulmones con EPOC muestran anomalías en su firma genética y en qué medida se pueden encontrar anomalías en las MSC de fuentes extrapulmonares en pacientes con EPOC. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar el transcriptoma de LMSC, BM-MSC y AD-MSC de pacientes con EPOC y controles sin EPOC. Estudiamos las diferencias en los perfiles de expresión génica entre los subtipos de MSC, así como entre la EPOC y el control mediante secuenciación de ARN (RNA-seq).

Asignaturas

El tejido pulmonar parenquimatoso era material sobrante derivado de 7 pacientes con enfisema y EPOC en estadios GOLD III-IV que se sometieron a trasplante de pulmón, resección del tumor o cirugía de reducción de volumen pulmonar y de material pulmonar sobrante de 7 controles sin EPOC que se sometieron a cirugía de resección del tumor. Se recolectó tejido pulmonar distante del tumor y un patólogo experimentado lo revisó en busca de anomalías y, si estaba indicado, se lo excluyó de nuestro estudio. Se recolectó tejido adiposo subcutáneo de 4 pacientes con enfisema sometidos a cirugía de reducción de volumen pulmonar broncoscópica (de 3 de ellos también recolectamos tejido pulmonar), cirugía de cáncer de pulmón, cirugía de resección tumoral o trasplante de pulmón y 3 controles sin EPOC sometidos a cirugía de resección tumoral (de 1 de estos también recolectamos tejido pulmonar). El protocolo del estudio fue consistente con el Código de Investigación del Centro Médico Universitario de Groningen (https://umcgresearch.org/en-GB/w/research-code-umcg) y directrices éticas y profesionales nacionales (https://www.coreon.org). Se recolectó médula ósea de discos de vertebrados de 7 pacientes con EPOC y 7 controles sin EPOC (Escuela de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, Pensilvania). Ver tabla 1 por las características del paciente.

Aislamiento celular y cultivo.

Se adquirieron LMSC de ~ 5 mm² bloques de tejido pulmonar parenquimatoso periférico como se describe en el archivo adicional 1. Se aislaron AD-MSC de 1 cm³ cubos de tejido adiposo subcutáneo y BM-MSC que aislamos de discos de vertebrados como se describe en el archivo adicional 1.

Después de descongelar, las LMSC, AD-MSC y BM-MSC se cultivaron hasta la confluencia, se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 2 a 3 días en DMEM con bajo contenido de glucosa con suero de ternera fetal (FCS) al 10 %, L-glutamina al 1 %, 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco) a ~ 90% de confluencia,…