Relación entre la ferroptosis mediada por ACSL4 y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad común y frecuentemente recurrente en la práctica clínica, caracterizada principalmente por una disminución lenta de la función pulmonar y una limitación progresiva del flujo aéreo, que no es completamente reversible y afecta severamente la capacidad de trabajo de los pacientes y su calidad de vida. vida y crea una enorme carga social y económica.^1,2 El humo del cigarrillo es el principal factor de riesgo de la EPOC, pero el mecanismo de la EPOC mediada por el humo no se comprende por completo y debe aclararse más. Uno de los principales cambios patológicos en la EPOC es el daño al tejido epitelial pulmonar, y su mecanismo de regulación es complejo. Las principales vías reconocidas en la patología de la EPOC se asocian principalmente con la inflamación de las vías respiratorias, el estrés oxidativo y el desequilibrio proteasa-antiproteasa. Sin embargo, en los últimos años, algunos estudios han presentado nuevas ideas. Cuando se administraron nanopartículas de óxido de hierro a ratas, los radicales libres aumentaron significativamente y el glutatión se redujo significativamente, mientras que los hallazgos histológicos mostraron que las nanopartículas causaron enfisema, congestión mesenquimatosa e inflamación pulmonar en ratas, lo que confirma los efectos tóxicos de las nanopartículas de hierro en el tejido pulmonar.³

La ferroptosis celular es un nuevo patrón de muerte celular caracterizado por la acumulación de peróxidos de lípidos dependientes de hierro y se ha demostrado que está involucrado en los procesos fisiopatológicos de muchas enfermedades.⁴ CS media la ferroptosis en las células epiteliales y promueve el desarrollo de la EPOC.⁵ Sin embargo, la correlación entre la ferroptosis y la EPOC sigue sin estar clara y debe investigarse más a fondo.

El miembro 4 de la familia de cadena larga de acil-CoA sintetasa (ACSL4) puede promover la producción de fosfatidiletanolamina (PE) a partir de ácido araquidónico (AA) y adrenalina, que está estrechamente relacionada con la ferroptosis.^6,7 Varios estudios han demostrado que ACSL4 puede mediar en la ferroptosis y participar en la aparición y el desarrollo de diversas enfermedades, pero no se ha informado sobre el papel y el mecanismo de ACSL4 en la EPOC.^8–10 Usando el análisis KEGG, se encontró que ACSL4 está estrechamente relacionado con la ferroptosis. Además, los investigadores que descargaron el análisis de los datos experimentales del chip sin procesar (GSE18344) de la base de datos GEO encontraron que ACSL4 estaba anormalmente elevado en el tejido pulmonar de los ratones expuestos al humo del cigarrillo.¹¹ mientras que una búsqueda en la base de datos de proteinatlas reveló la expresión de ACSL4 en células epiteliales de pulmón humano. Por lo tanto, es probable que ACSL4 participe en el desarrollo de la EPOC mediando la ferroptosis de las células epiteliales pulmonares. En el presente estudio, se validó la ferroptosis en la EPOC inducida por el humo del cigarrillo tanto a nivel animal como celular, y se investigó si ACSL4 media la ferroptosis en las células epiteliales pulmonares de la EPOC mediante la construcción de lentivirus de interferencia y siRNA para proporcionar una nueva dirección para la patogénesis de la EPOC. y una nueva idea para el tratamiento dirigido de la EPOC.

Materiales y métodos

Preparación de extracto de humo de cigarrillo (CSE)

Como se informó anteriormente,¹² cinco cigarrillos (alquitrán: 11 mg; nicotina 1 mg; monóxido de carbono 11 mg) (Liqun, Zhejiang China Tobacco Industry Co., Ltd., China) se quemaron y recolectaron en recipientes que contenían 10 ml de PBS para disolver la mayor cantidad posible. El pH se ajustó a 7,2–7,4 y luego la solución se filtró con un filtro de 0,22 μm con fines experimentales. El CSE se preparó antes de cada experimento para garantizar que el CSE utilizado fuera fresco.

modelos animales

Se seleccionaron ratones BALB/c macho de seis semanas de edad de grado libre de patógenos específicos (SPF) y pesaron entre 21 y 23 g (Liaoning Changsheng Biotechnology co., Ltd., Benxi, Liaoning, China). Después de una semana de alimentación adaptativa, los ratones se asignaron aleatoriamente a cuatro grupos (Control, CSE, CSE+LV-shNC, CSE+LV-shACSL4), cada uno de los cuales constaba de 6 animales. Los ratones del grupo de control recibieron 0,3 ml de PBS por vía intraperitoneal los días 0, 11 y 22, mientras que los ratones de los tres grupos restantes recibieron 0,3 ml de CSE por vía intraperitoneal los días 0, 11 y 22. Ratones en CSE+LV-shNC y los grupos CSE+LV-shACSL4 recibieron infusiones intratraqueales de vector lentiviral que contiene una secuencia no relacionada (LV-shNC) (Fenghbio, BR004, Changsha, Hunan, China) y vector lentiviral que contiene ACSL4 (LV-shACSL4) (10⁸ TU/ml) (Fenghbio, BR004, Changsha, Hunan, China) el día 14, respectivamente, mientras que los ratones de los grupos control y CSE recibieron transfusiones intratraqueales de un volumen igual de PBS el día 14.^12,13 Cada grupo de ratones se sacrificó el día 28 y se recogió tejido pulmonar para evaluaciones de seguimiento. Antes de ser sacrificados el día 28, la frecuencia respiratoria (f) y la pausa mejorada (Penh) de los ratones en cada grupo se detectaron con un sistema de prueba de función pulmonar no invasivo para animales pequeños (interfaz analógica-16, Emka, Francia) . Con la aprobación del Comité de Ética del Hospital Central afiliado a la Facultad de Medicina de Shenyang, el estudio se realizó de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.

Tinción con hematoxilina-eosina (H&E)

Se inmovilizó tejido pulmonar de ratones con EPOC durante la noche en paraformaldehído al 4 %, se deshidrató en etanol y se incluyó en parafina. Los cubos de cera de muestra se cortaron en rodajas de 5 μm y se tiñeron con hematoxilina (Solarbio, H8070, Beijing, China) y eosina (Sangon, A600190, Shanghai, China). Las secciones fueron observadas y fotografiadas bajo un microscopio. Se midieron el intercepto lineal medio (MLI) y el índice de destructividad (DI) para evaluar el enfisema.^12,13

Tinción con azul de Prusia

Se usó tinción con azul de Prusia (Servicebio, G1029, Wuhan, Hubei, China) para observar la deposición de hierro en el tejido pulmonar. Se añadió gota a gota solución de tinción de azul de Prusia a las secciones de tejido pulmonar preparadas durante 1 hora. Después de enjuagar con agua destilada, se añadió solución de tinción de azul de Prusia y se tiñó durante 3 minutos. Finalmente, las lonchas se lavaron con agua hasta que el agua corriente era incolora, se deshidrataron con etanol anhidro y se añadió goma neutra para sellar las lonchas. El efecto de tinción se observó al microscopio y se fotografió.

Cultivo Celular e Intervención

Se cultivaron células BEAS-2B epiteliales bronquiales humanas normales (iCell, iCell-h023, Shanghái, China) en DMEM (Servicebio, G4510, Wuhan, Hubei, China) que contenía suero bovino fetal al 10 % (Evergreen, 11011-8611, Hangzhou, Zhejiang , China) en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO₂.

(1) Las células BEAS-2B se distribuyeron aleatoriamente en 5 grupos. Los grupos de intervención de CSE fueron tratados con 5% de CSE durante 24 horas. Los grupos CSE+Fer-1 se cointervinieron con CSE al 5 % y ferrostatina-1 (Fer-1) 1 μM, 5 μM y 10 μM (Yuanye Bio, S81461, Shanghái, China) durante 24 horas respectivamente. Finalmente, el grupo de control no recibió ningún tratamiento. Se seleccionó la mejor concentración de Fer-1 para experimentos posteriores en esta sección.

(2) Se transfectaron células BEAS-2B en etapa logarítmica con ARNsi ACSL4 (General Biol, Anhui, China) o NC (General Biol, Anhui, China) durante 48 horas y se dividieron en cinco grupos, siNC, siNC+CSE, siACSL4, siACSL4+CSE y siACSL4+CSE+Fer-1, y todas las células se recogieron al mismo tiempo 24 horas después de la cointervención con CSE al 5 % o CSE al 5 % + Fer-1 5 μM.⁵

Ensayo de viabilidad celular

Las células se inocularon en placas de cultivo de 96 pocillos con 3×10³ células por agujero. Después de que se completaron las condiciones de tratamiento, se agregó el Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Wanleibio, WLA074, Shenyang, China) y las células se colocaron en incubadoras a 37 °C y 5 % de CO₂, por 2 horas. La DO se determinó a 450 nm.

Detección de contenido de iones de hierro

Se usó un mililitro de tampón de detección para resuspender las células, que luego se homogeneizaron en un baño de hielo y se centrifugaron a 16 000 × g durante 10 min a 4 ℃, después de lo cual se recolectó el sobrenadante y se usó un kit de detección de hierro (abcam, Ab83366, shanghai , China) se utilizó para detectar el contenido de iones de hierro. La concentración estándar fue la ordenada, el valor OD calibrado fue la abscisa y la concentración correspondiente se calculó de acuerdo con la curva estándar.

Transmisión de detección de ROS de lípidos

Las células se cultivaron en placas de 6 pocillos, se trataron como se describe anteriormente y se analizaron después de alcanzar el punto de tiempo. Se añadió C11-BODIPY581/591 (2 μM) (Maokangbio, MX5211, Shanghai, China) a las células después de que se completaron las condiciones de tratamiento y se incubaron durante 20 min. Las células se lavaron dos veces con PBS y se recogieron. Después de resuspender las células, se realizó una citometría de flujo.

Detección de marcadores relacionados con la ferroptosis

Se tomó para ensayo la suspensión celular o el sobrenadante del homogeneizado de tejido. Se preparó una curva estándar de proteína usando un kit de ensayo de concentración de proteína BCA (Wanleibio, WLA004, Shenyang, China), se calculó la concentración de proteína en cada muestra usando una curva estándar y se estandarizaron las concentraciones de proteína. Los niveles de superóxido dismutasa (SOD), malondialdehído (MDA) y glutatión (GSH) se midieron utilizando superóxido dismutasa (Wanleibio, WLA110, Shenyang, China), malondialdehído (Wanleibio, WLA048, Shenyang, China) y kits de glutatión reducido (Wanleibio, WLA105 , Shenyang, China).

PCR en tiempo real

El ARN total se extrajo de tejidos o células usando TRIzol (BioTeke, RP1001, Beijing, China), y las muestras de ARN resultantes se transcribieron inversamente usando BeyoRT II M-MLV (BeyoTime, D7160L, Shanghái, China) transcriptasa inversa para producir el ADNc correspondiente . El análisis de PCR en tiempo real se realizó en un instrumento Exicycler 96 (Bioneer Corporation, Daejeon, Corea) usando un SYBR Green PCR Kit (Solarbio, SY1020, Beijing, China). La expresión relativa de ARNm se normalizó a β-actina. Las secuencias de los cebadores se muestran en tabla 1. Las secuencias de interferencia y las secuencias de control negativo se muestran en Tabla 2.

tabla 1 Lista…