Revelación de biomarcadores de lncRNA relacionados con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica basados ​​en bioinformática

Introducción

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una bronquitis crónica común o enfisema caracterizado por síntomas respiratorios crónicos y restricción del flujo de aire, que puede convertirse en enfermedades crónicas comunes de enfermedad cardíaca pulmonar e insuficiencia respiratoria.¹ La prevalencia de la EPOC es cada vez más mundial, lo que se convierte en una gran carga individual y social.² Como la EPOC a menudo está marcada por rinovirus (RV), las exacerbaciones agudas con frecuencia conducen a la morbilidad y mortalidad de estos pacientes.³ Aunque el tabaquismo y el envejecimiento son las principales causas de la EPOC.⁴ Sin embargo, el mecanismo patológico de la EPOC sigue siendo limitado. El mecanismo fisiopatológico subyacente es urgente para desarrollar nuevas terapias para la EPOC.

La desregulación de la expresión de ARNm y miARN también se observó en la EPOC.⁵ Una micromatriz de epitelio de la EPOC examina la expresión génica de la familia TLR y revela que TLR5 es esencial para la activación de las respuestas inmunitarias innatas en la EPOC. Los genes relacionados con el envejecimiento también se expresaron de manera diferente en la EPOC.⁶ El perfil distinto de miARN también se observó en la EPOC.⁷ Además, el estudio mostró que MicroRNA-218 regulaba la sobreproducción de MUC5AC y la inflamación de la EPOC al dirigirse a la vía NF-κB mediada por TNFR1. Recientemente, se informó que el microARN-21 media en la patogénesis de la EPOC al regular el eje SATB1/S100A9/NF-κB.⁸

Los estudios emergentes mostraron que los factores genéticos también son determinantes importantes de la EPOC. El ARN no codificante largo (lncRNA) es un tipo de ARN no codificante monocatenario con una longitud de más de 200 nucleótidos que participa en varios procesos biológicos mediante la manipulación de la expresión génica.⁹ Recientemente, se ha documentado que los lncRNA desempeñan un papel clave en diversas funciones biológicas y están involucrados en diversas enfermedades, incluidas la EPOC y la enfermedad de las vías respiratorias.¹⁰ Un estudio reciente reveló perfiles de expresión de lncRNA significativamente diferentes en fumadores con o sin EPOC. Además, se informó que los lncRNAs realizan funciones esenciales en la progresión de la EPOC. Se informó que lncRNA TUG1 reduce la proliferación en la EPOC al inducir -β.¹¹ La investigación de Li et al mostró que lncRNA MIR155HG regula la polarización de macrófagos en la EPOC.¹² Zheng et al encontraron que lncRNA COPDA1 promueve la proliferación de células del músculo liso bronquial humano en la EPOC.¹³ Como regulador clave de miRNA, se informó que lncRNA regula la progresión de la EPOC al dirigirse a miRNA y mRNA.^14,15 Sin embargo, el panorama de la red ceRNA de la EPOC es limitado.

En este estudio, realizamos un análisis diferencial de genes y perfiles de expresión de miARN en pacientes con EPOC para obtener genes y miARN relacionados con la EPOC, y construimos una red de ceARN de EPOC basada en la interacción entre genes, miARN y lncARN en la base de datos lncACTdb. Y luego se utilizó Cytoscape para realizar un análisis topológico en la red ceRNA, y obtuvimos 10 lncRNA como nodos centrales, que se esperaba que se convirtieran en objetivos terapéuticos potenciales para la EPOC.

Materiales y métodos

Recopilación de datos

Buscamos los perfiles de expresión de ARNm y miARN de pacientes con EPOC en la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) en función de las palabras clave “COPD”, “Home sapiens”, “perfiles de ARNm” y “perfiles de miARN”. Se identificaron un total de 16 artículos. Finalmente, después de la detección de la presencia o ausencia de muestras normales y la fuente de las muestras, se utilizaron 148 muestras de los cuatro estudios para análisis posteriores. La información detallada del conjunto de datos se muestra en tabla 1.

tabla 1 conjuntos de datos

Preprocesamiento de datos y análisis de expresión diferencial

Se descargaron los datos originales y se utilizó el paquete R “limma” para el análisis. En primer lugar, se normalizaron los datos originales (log2), y luego se analizaron los genes expresados ​​de manera diferente entre muestras con EPOC y normales (funciones lmFit y eBay) con el umbral utilizado de cambio de pliegue (log2) de 1 y un valor de p de 0,05. Cada conjunto de datos se analizó por separado. Los mapas de volcanes y los mapas de calor de expresión génica se realizaron mediante el paquete R “ggplot2 y pheatmap”.

Análisis de red PPI

La red de interacción proteína-proteína (PPI) puede ayudarnos a identificar los genes clave para la aparición y el desarrollo de la EPOC desde el nivel de interacción. Obtenga la información de PPI de DEG de la herramienta de búsqueda para la recuperación de la base de datos de genes interactivos (STRING) (http://www.string-db.org/).¹⁰ Luego, se utilizó el software Cytoscape v3.7.0 para analizar la topología de la red PPI en la EPOC y se construyó la red PPI.

Análisis de enriquecimiento GO/KEGG

Para estudiar las funciones biológicas de DEG, se utilizó el paquete R ClusterProfiler para analizar y visualizar el mapa funcional de DEG (anotación de ontología genética (GO) y ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG)) y el paquete R anotativo ( org.Hs.eg.db) como fondo. El valor de p <0,05 es estadísticamente significativo.

Enriquecimiento de funciones de Hallmark

Para explorar el enriquecimiento de DEG en el estado y proceso biológico, el conjunto de genes Hallmark se descargó de la base de datos MsigDB, y el conjunto de genes de cada vía en el sello distintivo y la superposición de DEG se calcularon mediante análisis hipergeométrico. El umbral de enriquecimiento es un valor de P <0,05.

Construcción de la Red ceRNA

El lncACTdb 2.0 (http://www.bio-bigdata.net/LncACTdb/) la base de datos contenía las relaciones de interacción de ceRNA de múltiples documentos. Los DEG y DEmis se enviaron a la base de datos y luego se obtuvieron los lncRNA relacionados, las interacciones entre DEG y lncRNA, DEmi y lncRNA, y DEG y DEmiRNA. De acuerdo con la teoría ceRNA, los DEmi y DEG, DEmi e lncRNA, y DEG e lncRNA seleccionados se integraron e interactuaron entre sí, y la red de ceRNA DEmi-DEG-lncRNA se construyó utilizando el software Cytoscape v3.7.0.

Análisis estadístico

Todos los datos se analizaron utilizando R (v 4.0.3). El análisis de las diferentes expresiones se realizó utilizando los paquetes R “limma”. Se usaron las pruebas t de Student para calcular los valores P mediante la función de prueba t. Los mapas de calor fueron generados por el paquete pheatmap R (v 1.0.12).

Resultado

Se examinaron DEG y DEmi relacionados con la EPOC

En primer lugar, se obtuvieron los 519 DEG de la expresión de ARNm entre muestras de EPOC y muestras normales de tres conjuntos de datos GEO con un valor de p <0,05 y |logFC|>1. Entre ellos, se identificaron 233 DEG regulados al alza, 240 DEG regulados a la baja en el conjunto de datos GSE38974; Se identificaron 10 DEG regulados al alza y 12 DEG regulados a la baja en el conjunto de datos GSE103174, y 16 DEG regulados al alza y 31 DEG regulados a la baja se identificaron en el conjunto de datos GSE135188. El mapa de volcanes DEG de los tres conjuntos de datos anteriores se muestra en Figura 1A–Cy el mapa de calor se muestra en Figura 1D–F. En el mapa de calor de expresión de DEG, hubo una heterogeneidad significativa entre la expresión de DEG en muestras de EPOC y muestras normales. A continuación, usamos los 519 DEG para construir una red PPI en Figura 1G. En la red PPI-DEG construida, hubo un total de 139 DEG y 166 relaciones de interacción. Entre ellos, UBD, H2AFX, BAG3 y CDKN1A fueron genes clave en la red de la EPOC. Zhang et al determinaron los marcadores de genes modulares que contenían H2AFX mediante el análisis de la red de interacción de proteínas como un marcador para distinguir la EPOC y el NSCLC.^dieciséis Sun et al identificaron 40 genes potenciales relacionados con la EPOC a través del análisis bioinformático y encontraron que HIF1A, CDKN1A, BAG3, ERBB2 y ATG16L1 pueden afectar el desarrollo de la EPOC al regular la autofagia.¹⁷

Figura 1 El DEG en muestras de EPOC y muestras normales. (A) Los gráficos de volcanes de DEG en la EPOC utilizando el conjunto de datos GSE38974. (B) Los gráficos de volcanes de DEG en la EPOC utilizando el conjunto de datos GSE103174. (C) Los gráficos de volcanes de DEG en la EPOC utilizando conjuntos de datos GSE135188. El gen regulado al alza era rojo y los genes regulados a la baja eran azules. El parámetro de filtro de los DEG fue |log2 (FC)|> 1 y P <0,05. (D) Los mapas de calor de DEG en muestras de EPOC y muestras normales usando GSE38974. (mi) Los mapas de calor de DEG en muestras de EPOC y muestras normales en el GSE103174. (F) Los mapas de calor de DEG en muestras de EPOC y muestras normales en los conjuntos de datos GSE135188. (GRAMO) La red de DEG en EPOC.

A continuación, seleccionamos 17 DEmis del conjunto de datos GSE38974 utilizando el mismo umbral que el utilizado para obtener DEG, incluidos 11 DEmis regulados al alza y 6 DEmis regulados a la baja. El mapa del volcán y el mapa de calor de DEmis se muestran en Figura 2A y Brespectivamente.

Figura 2 Los microARN diferenciales (DEmi) en muestras de EPOC y muestras normales. (A) Los gráficos de volcanes de DEmi obtenidos del conjunto de datos GSE38974 con P <0,05 y |log2 (FC)|> 1. El rombo pequeño presenta los microARN. (B) El mapa de calor de DEmis de muestras de EPOC y muestras normales en el conjunto de datos GSE38974.

Enriquecimiento Funcional de DEG en EPOC

Para explorar la importancia biológica de las características de la EPOC, se utilizaron todos los DEG de GSE38974, GSE103174 y GSE135188 para el análisis GO/KEGG utilizando los conjuntos de genes Hallmark en MSigDB. Como se muestra en Figura 3A, GO enriquecimiento mostró que la quimiotaxis de leucocitos, la quimiotaxis celular y la migración de leucocitos mieloides estaban reguladas al alza, y los progresos biológicos relacionados con la repolarización de la membrana y el músculo estaban regulados a la baja en la EPOC. El antagonista del receptor de citoquinas CXCR2 (MK-7123) redujo la quimiotaxis de los neutrófilos, lo que puede aliviar la inflamación de las vías respiratorias de la EPOC.¹⁸ y el entrenamiento aeróbico combinado con el estiramiento de los músculos respiratorios mejoró la capacidad de ejercicio funcional de los pacientes con EPOC y redujo la disnea.¹⁹ En Figura 3B, el enriquecimiento de la vía KEGG muestra que la vía p53 estaba regulada positivamente en la EPOC. El polimorfismo de la vía de señalización p53 se asoció con cambios en el enfisema en pacientes con EPOC,²⁰ y en comparación con no fumadores, fumadores sanos y fumadores con EPOC debido a la apoptosis de las células endoteliales capilares pulmonares activas,…