TGF-β1 promueve la expresión de SCD1 a través de la vía de señalización PI3K-Akt-mTOR-SREBP1 en fibroblastos de pulmón

Fondo

La activación de fibroblastos pulmonares se asocia con la remodelación de las vías respiratorias durante la progresión del asma. La estearoil-CoA desaturasa 1 (SCD1) juega un papel importante en la respuesta de los fibroblastos a los factores de crecimiento. Este estudio tuvo como objetivo explorar los efectos de SCD1 en la activación de fibroblastos inducida por el factor de crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) y el papel de la fosfatidilinositol-3-quinasa-AKT serina-treonina proteína quinasa-diana mecánica de la rapamicina (PI3K-Akt -mTOR) sobre la regulación de la expresión de SCD1 en la remodelación de las vías respiratorias.

Métodos

Ratones hembra C57BL/6 fueron sensibilizados y desafiados con ácaros del polvo doméstico para generar un modelo de asma crónica. El inhibidor de SCD1 se inyectó ig antes de cada desafío. Se evaluó la hiperreactividad de las vías respiratorias a la metacolina y se evaluaron histológicamente la remodelación y la inflamación de las vías respiratorias. Los efectos de SCD1 sobre la activación de fibroblastos se evaluaron in vitro utilizando un inhibidor de SCD1 y ácido oleico y mediante la eliminación de SCD1. Se investigó la participación de la vía de la proteína de unión al elemento regulador 1 (SREBP1) PI3K-Akt-mTOR-esterol en los fibroblastos pulmonares utilizando inhibidores relevantes.

Resultados

La expresión de SCD1 aumentó en fibroblastos expuestos a TGF-β1. La inhibición de SCD1 mejoró notablemente la remodelación de las vías respiratorias y la activación de fibroblastos pulmonares en las vías respiratorias periféricas. La eliminación o inhibición de SCD1 dio como resultado una producción de matriz extracelular significativamente reducida en fibroblastos tratados con TGF-β1, pero este efecto se revirtió mediante la adición de ácido oleico exógeno. Se descubrió que la vía PI3K-Akt-mTOR-SREBP1 está involucrada en la regulación de la expresión de SCD1 y la activación de fibroblastos pulmonares.

Conclusiones

Los datos obtenidos en este estudio indican que la expresión de SCD1 contribuye a la activación de fibroblastos y remodelación de las vías respiratorias y que la inhibición de SCD1 puede ser una estrategia terapéutica para la remodelación de las vías respiratorias en el asma.

El asma es una enfermedad respiratoria crónica caracterizada por obstrucción reversible del flujo de aire, inflamación crónica, remodelación de las vías respiratorias e hiperreactividad de las vías respiratorias (AHR). [1]. La remodelación de las vías respiratorias ocurre durante la progresión de la enfermedad y conduce a cambios estructurales crónicos, que incluyen desprendimiento epitelial, hiperplasia de células caliciformes, hipertrofia del músculo liso de las vías respiratorias, engrosamiento de la membrana basal y fibrosis subepitelial. [2]. Tras la activación, los fibroblastos pulmonares expresan la proteína del citoesqueleto alfa-actina del músculo liso (α-SMA) y producen quimiocinas y proteínas de la matriz extracelular (ECM), incluidas fibronectinas y colágenos, lo que conduce a la fibrosis subepitelial. [3]. El depósito excesivo de proteínas de la MEC es una característica del asma crónica y provoca rigidez y estrechamiento de la luz de las vías respiratorias en pacientes con asma [4, 5]. El factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) es un mediador importante que activa los fibroblastos [6]. Se han observado niveles elevados de TGF-β1 en líquido de lavado broncoalveolar (BALF) de pacientes asmáticos [7].

La estearoil-CoA desaturasa 1 (SCD1) es una enzima limitante de la velocidad responsable de la lipogénesis de novo que está anclada en la membrana del retículo endoplásmico y cataliza la formación de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) a partir de ácidos grasos saturados (SFA) [8]. La expresión de SCD1 está disminuida en las células epiteliales bronquiales de pacientes con asma [9]. Sin embargo, los efectos de SCD1 sobre la activación de fibroblastos en la remodelación de las vías respiratorias siguen sin estar claros.

La proteína de unión a elementos reguladores de esteroles 1 (SREBP1) es un regulador transcripcional clave de las enzimas involucradas en el metabolismo de los ácidos grasos [10]. Después de la escisión en el retículo endoplásmico, SREBP1 ingresa al núcleo y se une a una secuencia de ADN específica para activar la transcripción de los genes lipogénicos acetil-CoA carboxilasa alfa (ACACA), ácido graso sintasa (FASN) y SCD1 [11]. Los datos disponibles demuestran cada vez más que el objetivo mecanicista de la rapamicina (mTOR) es responsable de la activación de SREBP1 y la síntesis de lípidos en presencia de factores de diferenciación y proliferación celular [12, 13].

En este estudio, demostramos que TGF-β1 promovió la expresión de SCD1 en fibroblastos de pulmón. La inhibición o eliminación de SCD1 no solo suprimió la diferenciación de miofibroblastos, sino que también atenuó la remodelación de las vías respiratorias, y estos efectos se aliviaron mediante la adición de ácido oleico (OA) exógeno. Además, TGF-β1 promovió la expresión de SCD1 a través de la señalización PI3K-Akt-mTOR-SREBP1. Nuestros resultados sugieren que SCD1 es esencial para la activación de fibroblastos en respuesta a TGF-β1 e indican un nuevo objetivo terapéutico en el tratamiento de la remodelación de las vías respiratorias en el asma.

reactivos

El extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM) se adquirió de los laboratorios Greer (Lenoir, NC, EE. UU.). Los kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para inmunoglobulina E (IgE) se compraron de RayBiotech (Norcross, GA, EE. UU.). El TGF-β1 humano recombinante se adquirió de R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.). El inhibidor de SCD1 A939572 y el inhibidor de PI3K LY294002 se adquirieron de MedChemExpress (Shanghai, China). El inhibidor de SREBP1 Fatostatin HBr y el inhibidor de mTOR Torin1 se adquirieron de Selleck (Shanghai, China). La albúmina sérica bovina (BSA) OA se adquirió de Sigma‒Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El ARN de interferencia pequeño dirigido a SCD1 (siSCD1) y el ARN de interferencia pequeño de control negativo (siNC) se obtuvieron de GenePharma (Suzhou, China). La información de la secuencia de siRNA se enumera en el archivo adicional 1: Tabla S1. Los cebadores utilizados en este estudio fueron sintetizados por Synbio Technologies (Suzhou, China). Las proteínas citosólicas, nucleares y de membrana se extrajeron usando un Minute™ Plasma Membrane Protein Aislation and Cell Fractionation Kit (Invent Biotechnologies, Beijing, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos utilizados se enumeran en el archivo adicional 1: Tabla S2.

Cultivo celular, tratamiento con inhibidores y transfección

La línea celular de fibroblastos de pulmón fetal humano (HFL1) se obtuvo de nuestro laboratorio como se describió anteriormente [14]. Las células HFL1 se cultivaron en medio F12K suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Gibco, Nueva Zelanda) a 37 °C en una atmósfera con 5 % de CO₂. Una vez que las células HFL1 alcanzaron una confluencia del 80-90%, se colocaron en medio libre de suero durante 24 h y luego se trataron con inhibidores y TGF-β1 durante los tiempos indicados. La transfección de siRNA se realizó con un reactivo de transfección (Lipofectamine 3000 de Invitrogen) según el protocolo del fabricante.

Animales y modelo de asma crónica inducida por HDM

Se obtuvieron ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad de la Southern Medical University y se alojaron en condiciones libres de patógenos con ciclos de luz/oscuridad de 12 h. Los ratones fueron aclimatados durante una semana antes del inicio de los experimentos. Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con las pautas de uso de animales de la Universidad Médica del Sur, y los protocolos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica del Sur. Se utilizaron un total de 40 ratones (n = 10 en cada grupo experimental). Los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: (1) grupo de control, ratones sensibilizados/expuestos a PBS con solución salina tamponada con fosfato (PBS) tratados con el disolvente; (2) grupo HDM, ratones sensibilizados con HDM/expuestos a HDM tratados con el disolvente; (3) grupo A93, ratones sensibilizados con PBS/desafiados con PBS tratados con A939572; y (4) grupo HDM + A93, ratones sensibilizados con HDM/expuestos a HDM tratados con A939572.

Brevemente, los ratones se sensibilizaron con 25 μg de extracto de HDM diluido en 100 μl de PBS los días 1 y 8 mediante inyecciones intraperitoneales. A partir del día 15, los ratones se expusieron intranasalmente a 25 μg de extracto de HDM (en 20 μl de PBS) durante 5 días consecutivos y luego se les permitió descansar durante 2 días, y este ciclo se repitió durante 5 semanas. Los ratones de control se sensibilizaron o desafiaron con el mismo volumen de PBS. Los ratones recibieron alimentación forzada con A939572 (5 mg/kg) 2 h antes de la exposición y los ratones de control recibieron el mismo volumen de disolvente para comparación. Él…