Transcripción de vías respiratorias y parénquima en un modelo experimental de asma con ácaros del polvo doméstico

by | Ene 27, 2023 | 0 comments

Resumen

Los estudios de transcriptómica pulmonar en el asma han proporcionado información valiosa en todo el contexto pulmonar; sin embargo, descifrar las contribuciones individuales de las vías respiratorias y el parénquima en la patogénesis de la enfermedad puede acelerar el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento dirigidas. En este estudio, realizamos transcriptómica en las vías respiratorias y el parénquima utilizando un modelo de asma experimental inducido por ácaros del polvo doméstico (HDM) que replica las características clave de la enfermedad humana. La exposición a HDM aumentó la expresión de 3255 genes, de los cuales 212 aumentaron únicamente en las vías respiratorias, 856 aumentaron únicamente en el parénquima y 2187 aumentaron comúnmente en ambos compartimentos. El interrogatorio adicional de estos genes utilizando una combinación de análisis de enriquecimiento de factor de transcripción y red identificó varios factores de transcripción que regulan la expresión génica de las vías respiratorias y/o del parénquima, incluido el factor de transcripción EC (TFEC), el factor de transcripción PU.1 (SPI1), H2.0- como el homeobox (HLX), el factor de transcripción de unión al elemento de respuesta metálica 1 (MTF1) y el factor 4 similar a E74 (factor de transcripción del dominio ets, ELF4) involucrados en el control de las respuestas inmunitarias innatas. A continuación, evaluamos los efectos de inhibir las respuestas de SPI1 pulmonar utilizando DB1976 y DB2313 disponibles comercialmente en los resultados clave de la enfermedad. Descubrimos que ninguno de los compuestos tuvo efectos protectores sobre la inflamación de las vías respiratorias; sin embargo, DB2313 (8 mg/kg) disminuyó el número de células secretoras de moco, y tanto DB2313 (1 mg/kg) como DB1976 (2,5 mg/kg y 1 mg/kg) redujeron depósito de colágeno en las vías respiratorias pequeñas. Significativamente, ambos compuestos redujeron la hiperreactividad de las vías respiratorias. Este estudio demuestra que SPI1 es importante en el asma experimental inducida por HDM y que su inhibición farmacológica reduce la deposición de colágeno en las vías respiratorias inducida por HDM y la hiperreactividad.

Introducción

El asma es una enfermedad pulmonar inflamatoria crónica con síntomas comunes de sibilancias y dificultad para respirar asociada con la remodelación de las vías respiratorias y la hiperreactividad (AHR) [1,2,3]. Las terapias actuales, incluidos los broncodilatadores y los corticosteroides, pueden ser eficaces para controlar los síntomas y los productos biológicos dirigidos al tipo 2 más nuevos, como duplizumab, también pueden ser eficaces en subgrupos de pacientes con enfermedad provocada por el tipo 2 [4]. Sin embargo, quedan lagunas en nuestra comprensión de lo que impulsa las características clave de la enfermedad y las terapias actuales pueden no ser efectivas en todos los pacientes.

Los estudios transcriptómicos en asma han proporcionado información valiosa en el contexto de todo el pulmón [5,6,7]Sin embargo, descifrar las contribuciones individuales de las vías respiratorias y el parénquima en la patogénesis de la enfermedad puede acelerar el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento específicas de tejido. Un desafío importante en el estudio de los patrones de expresión génica es descifrar las relaciones entre un gran número de genes expresados ​​diferencialmente y los efectos funcionales generales. Para abordar esto, se está adoptando cada vez más un enfoque basado en redes para explorar sistemáticamente los cambios transcripcionales complejos y dinámicos que subyacen a enfermedades como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. [8,9,10,11,12,13]. Al utilizar herramientas bioinformáticas como el análisis de red de correlación genética ponderada (WGCNA) [14]el análisis de la red de coexpresión puede proporcionar una visión holística de la estructura de conectividad global y la organización funcional del programa de expresión génica e identificar cambios sutiles asociados a enfermedades en la estructura de correlación que no se detectan mediante el análisis de expresión génica diferencial convencional [11, 15]. Además, dado que los genes asociados a enfermedades a menudo interactúan para formar módulos de enfermedades [8]los conocimientos adquiridos a partir del análisis de la red de coexpresión se pueden aprovechar para inferir genes impulsores de módulos aguas arriba que controlan las vías completas de la enfermedad y pueden convertirse en objetivos terapéuticos prometedores [11, 16].

En este estudio, realizamos transcriptómica de las vías respiratorias y el parénquima utilizando un modelo de asma experimental inducido por ácaros del polvo doméstico (HDM) que replica las características clave de la enfermedad humana [17, 18]. El interrogatorio de los genes inducidos por HDM mediante el análisis del módulo aguas arriba de WGCNA identificó varios factores de transcripción que regulan la expresión génica de las vías respiratorias y/o del parénquima, incluido el factor de transcripción PU.1 (SPI1). La inhibición de SPI1 utilizando inhibidores de molécula pequeña específicos, DB1976 o DB2313, no tuvo efectos protectores sobre la inflamación de las vías respiratorias. Sin embargo, DB2313 (8 mg/kg) disminuyó el número de células secretoras de moco en las vías respiratorias, y DB2313 (1 mg/kg) y DB1976 (2,5 mg/kg y 1 mg/kg) redujeron la deposición de colágeno en las vías respiratorias pequeñas. Ambos compuestos disminuyeron la AHR. Este estudio revela diferencias importantes entre los perfiles transcriptómicos de las vías respiratorias y del parénquima en un modelo de asma inducido por HDM. También demostramos que SPI1 es importante en la patogénesis del asma experimental inducida por HDM y que su inhibición farmacológica reduce la deposición de colágeno inducida por HDM y AHR.

Materiales y métodos

Ratones y ética

Se alojaron ratones hembra BALB/c de tipo salvaje (Centro de Recursos Animales, Australia Occidental) en condiciones específicas libres de patógenos en las instalaciones PC2 del Hunter Medical Research Institute, Australia y se mantuvieron en un ciclo día-noche de 12 horas con agua y comida regular. disponible ad libitum. Se eligieron ratones hembra BALB/c para este estudio debido a su mayor susceptibilidad a la inflamación alérgica de las vías respiratorias inducida por HDM. [19]. Todos los estudios se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité de Ética y Cuidado Animal de la Universidad de Newcastle.

Modelo y tratamientos

Los ratones fueron tratados por vía intranasal con ácaros del polvo doméstico (HDM; Dermatophagoides pteronyssinus) extracto (25 µg en 30 µL de solución salina tamponada con fosfato [PBS]; 15G10, Citeq Biologics) o solución salina (vehículo), 5 días a la semana durante 3 semanas [17, 18]. Algunos grupos de ratones tratados con HDM se trataron con DB1976 (1 mg/kg o 2,5 mg/kg en PBS; #HY-135,797 A, MedChemExpress) o DB2313 (1 mg/kg o 8 mg/kg en PBS; #AOB33333, Aobioso).

Lavado broncoalveolar, células secretoras de moco (MSC) y depósito de colágeno

El líquido de lavado broncoalveolar se recogió como se describió anteriormente [20,21,22,23]. Las MSC se tiñeron y contaron como se describió anteriormente. [17, 24, 25]. El colágeno se tiñó y analizó como se describió anteriormente. [17, 18, 23, 25]. Se proporcionan detalles adicionales en el suplemento en línea.

qPCR

El ARN total se aisló de tejido pulmonar homogeneizado con reactivo TRIzol® (Invitrogen™) [26,27,28]. Se realizaron transcripciones inversas cebadas aleatoriamente seguidas de qPCR en tiempo real. La expresión del gen Spi1 (cebador directo: 5′-AAGCAGGGGATCTGACCAAC-3′; cebador inverso: 5′-AAGTCATCCGATGGAGGGGC-3′) se normalizó a la expresión del transcrito del gen de limpieza hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (Hprt) (cebador directo: 5′-AGGCCAGACTTTGTTGGATTTGAA-3′; cebador inverso: 5′-CAACTTGCGCTCATCTTAGGCTTT-3′). Todas las reacciones se realizaron utilizando transcriptasa inversa BioScript™ en tampón de primera hebra 1x de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bioline). Los ensayos de qPCR en tiempo real se realizaron con SYBR Green Supermix (KAPA Biosystems) y un sistema Mastercycler® ep realplex2 (Eppendorf South Pacific).

Función pulmonar

La hiperreactividad de las vías respiratorias se evaluó utilizando la técnica de oscilación forzada en una máquina Scireq Flexivent FX1 como se describió anteriormente [29, 30]. Se proporcionan detalles adicionales en el suplemento en línea.

Extracción de ARN, bioanálisis, secuenciación de ARN, expresión génica diferencial y análisis de redes

Los tejidos de las vías respiratorias y del parénquima pulmonar se separaron mediante disección roma bajo un microscopio de disección como se describió anteriormente. [22]. Los detalles para la extracción de ARN, bioanálisis, secuenciación de ARN y análisis se proporcionan en el suplemento en línea. La expresión génica diferencial y el análisis de redes se realizaron como se describió anteriormente. [16, 31, 32] y los detalles se proporcionan en el suplemento en línea.

Estadísticas

Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando una prueba t no pareada. Las comparaciones entre múltiples grupos se llevaron a cabo utilizando ANOVA unidireccional con…

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