Resumen
Antecedentes
El asma es una enfermedad heterogénea; por lo tanto, los biomarcadores que pueden ayudar en la identificación de subtipos y la terapia directa son muy deseables. El asma es una enfermedad inflamatoria crónica que conduce a cambios en la matriz extracelular (MEC) por la degradación de las metaloproteinasas de matriz (MMP) que provocan fragmentos de colágeno tipo I que se liberan a la circulación.
Objetivo
Aquí, preguntamos si el colágeno tipo I generado por MMP (C1M) estaba asociado con subtipos de asma.
Métodos
C1M se evaluó serológicamente al inicio del estudio en los participantes adultos del estudio All Age Asthma (ALLIANCE) (norte = 233), y en el estudio The Prospective Epidemiological Risk Factor (PERF) (norte= 283). Además, se evaluó C1M en ratones sensibilizados a ovoalbúmina (OVA) y expuestos a aerosol de OVA. C1M se evaluó en ratones con y sin inflamación neutrofílica aguda provocada por ácido poli(citidílico-inosínico) y ratones tratados con CP17, un péptido que inhibe la acumulación de neutrófilos.
Resultados
La C1M sérica aumentó significativamente en los asmáticos en comparación con los controles sanos (pags= 0,0005). Descubrimos que los niveles aumentados de C1M en asmáticos estaban relacionados con los neutrófilos en sangre y el índice de masa corporal (IMC) en la cohorte ALLIANCE, que se validó en la cohorte PERF. Cuando los pacientes se estratificaron en asmáticos obesos (IMC > 30) con niveles altos de neutrófilos y asma no controlada, este grupo tuvo un aumento significativo en C1M en comparación con los asmáticos de peso normal (IMC < 25) con niveles bajos de neutrófilos y asma controlada.pags= 0,0277). C1M fue significativamente elevado en ratones OVA con inflamación neutrofílica aguda en comparación con los controles (PAGS= 0,0002) y disminuyó en ratones tratados con un inhibidor de la infiltración de neutrófilos (pags= 0,047).
Conclusión y relevancia clínica
C1M tiene el potencial de identificar un subtipo de asma que se relaciona con la gravedad, la obesidad y los neutrófilos altos. Estos datos sugieren que C1M está relacionado con un subtipo de inflamación general, no solo derivada del pulmón. El vínculo entre C1M y los neutrófilos se validó aún más en en vivomodelo.
Registro de prueba
(ALIANZA, NCT02419274).
Introducción
La estimación global más reciente sugiere que 334 millones de personas tienen asma en todo el mundo. [1]. El asma se caracteriza por la inflamación crónica de las vías respiratorias asociada con hiperreactividad de las vías respiratorias que conduce a episodios recurrentes de sibilancias, tos, dificultad para respirar y opresión en el pecho. [2, 3]. La enfermedad es heterogénea con muchos fenotipos, pero uno de los endotipos más comunes se caracteriza por un alto número de T helper tipo 2 (TH2) células y un alto número de eosinófilos en el esputo[[4]. Se ha identificado una gama de biomarcadores para la alta TH2 asma, pero biomarcadores para no-THFaltan 2 endotipos de asma, también conocidos como endotipos de asma no eosinofílicos. [5, 6]. Sin embargo, los neutrófilos en esputo, los neutrófilos en sangre y la IL-17 se han propuesto como marcadores para el endotipo no eosinofílico. [7,8,9].
Una parte esencial de la patogenia del asma es la remodelación del tejido de las vías respiratorias. [10]. Los elementos específicos en la remodelación de las vías respiratorias y cómo contribuyen clínica y funcionalmente al asma son poco conocidos debido a la heterogeneidad de la enfermedad. [11, 12]. La remodelación de las vías respiratorias puede determinarse por análisis histológico o por una obstrucción irreversible de las vías respiratorias (volumen espiratorio forzado en 1 s posbroncodilatador (FEV1) <70%) [13, 14].
Durante la remodelación del tejido de las vías respiratorias, la fibrosis subepitelial da lugar a una alteración del contenido de la matriz extracelular (MEC), lo que contribuye a la patogenia del asma [15]. La existencia de fibrosis subepitelial en las vías respiratorias de los asmáticos sugiere un desequilibrio entre las metaloproteinasas de matriz (MMP) y sus inhibidores [16]. El colágeno tipo I es uno de los colágenos más abundantes en el pulmón sano y proporciona un marco estructural para la pared de las vías respiratorias. [17,18,19,20]. El colágeno tipo I juega un papel importante en la fibrosis subepitelial en las vías respiratorias asmáticas [17,18,19,20]. Debido al aumento de los niveles de MMP durante la inflamación en las vías respiratorias de los asmáticos, se alteran la cantidad y la calidad de la ECM. [21]. Un nivel excesivo de MMP puede conducir a una mayor degradación del colágeno tipo I, lo que resulta en una mayor producción de un fragmento de proteína específico conocido como C1M. C1M se libera en el torrente sanguíneo y se puede evaluar como un biomarcador de enfermedad mediante un ELISA no invasivo y se ha propuesto como un biomarcador inflamatorio del recambio de tejidos blandos en la artritis reumatoide (AR) [22, 23].
No-TH2 el asma se asocia con niveles elevados de neutrófilos más graves y obesidad [24,25,26,27]. El aumento de los niveles de neutrófilos en las vías respiratorias de los asmáticos puede dar lugar a una producción excesiva de elastasa de neutrófilos y MMP, lo que posiblemente provoque la remodelación de la MEC. [28, 29]. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que no-TH2 asmáticos tendrían niveles elevados de C1M en suero debido al aumento de la remodelación de la ECM en las vías respiratorias. El biomarcador C1M se midió serológicamente en el brazo adulto de la cohorte All Age Asthma (ALLIANCE) para evaluar la utilidad de C1M para estratificar las enfermedades no TH2 subtipos de asma. Los hallazgos fueron validados en el estudio Factor de Riesgo Epidemiológico Prospectivo (PERF). Además, se investigó C1M en un modelo de ratón de asma alérgico inducido por ovoalbúmina (OVA) para evaluar C1M como un biomarcador traducible.
Métodos
El diseño del estudio del grupo observacional multicéntrico de adultos de la Cohorte de Asma de TODAS las Edades (ALLIANCE) del Centro Alemán para la Investigación Pulmonar (DZL) (identificador de Clinicaltrials.gov NCT02419274) se describió previamente en detalle y fue aprobado por los comités de ética locales. [30]. Brevemente, el estudio presentado aquí incluye 233 participantes, incluidos 41 controles sanos, 86 asmáticos graves y 106 asmáticos leves a moderados. Los pacientes asmáticos incluidos dieron su consentimiento informado por escrito y tenían un diagnóstico establecido de asma según las directrices ERS/ATS 2014. Los criterios de exclusión del estudio fueron infección grave del tracto respiratorio superior o exacerbación grave durante las cuatro semanas anteriores. Los controles sanos no tenían ninguna enfermedad pulmonar pero podían presentar rinoconjuntivitis alérgica. La oscilometría de impulso evaluó la resistencia de las vías respiratorias pulmonares. De acuerdo con las pautas de GINA, el asma no controlada se definió como síntomas diurnos más de dos veces por semana, despertares nocturnos debido al asma, medicación de rescate necesaria más de dos veces por semana y cualquier limitación de la actividad debido al asma. [31, 32]. PERF es un estudio epidemiológico, que incluye 5855 mujeres posmenopáusicas danesas, que se ha descrito previamente en detalle [33]. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Científica del Condado de Copenhague (jr: KA 99 070 g) y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes. Todas las mujeres en PERF se compararon con el Registro Nacional de Pacientes de Dinamarca a través de un número de identificación personal (número CPR) [34]. Pacientes asmáticos (norte= 283) se extrajeron del estudio PERF utilizando la Clasificación Internacional de Enfermedades 10 de la OMS (ICD10: J45, J46). Los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki.
Modelo de ratón inducido por OVA de asma alérgica
El asma alérgica inducida experimentalmente en ratones se realizó como se describió anteriormente[[35, 36]. Brevemente, ratones hembra C57BL/6 de 6–8 semanas de edad (Charles River, Sulzfeld, Alemania) fueron sensibilizados a OVA (grado VI, Sigma, Deisenhofen, Alemania) mediante inyecciones intraperitoneales (ip) de 10 µg de OVA absorbidos en 150 µg de hidróxido de aluminio (Imject alumbre, Thermo, Rockford, Illinois, EE. UU.) los días 1, 14 y 21. Los ratones fueron desafiados con aerosol OVA (OVA grado V, Sigma, Deisenhofen, Alemania) (1 % p/vol en PBS) los días 26, 27 y 28 (norte= 76) para inducir una inflamación alérgica aguda de las vías respiratorias. El receptor tipo Toll (TLR)-3 ligando poli(citidílico-inosínico) (PolyIC) (Sigma-Aldrich, St Louise, Missouri, EE. UU.) provocó una inflamación neutrofílica aguda el día 28 (norte= 20). Los ratones fueron tratados con CRP17, una región activa de tumstatina que inhibe la entrada de neutrófilos, (norte= 18), o un péptido revuelto (norte= 18) [36]. Un grupo de control fue sensibilizado simuladamente a PBS y posteriormente desafiado con aerosol de OVA (norte= 20). Los ratones fueron sacrificados el día 29 por dislocación cervical bajo anestesia profunda. (Higo. 1). Los ratones se alojaron en condiciones libres de patógenos específicos y recibieron dieta libre de OVA y agua ad libitum. El comité de ética animal del Departamento de Estado, Kiel, Alemania, aprobó el estudio con animales.
Una descripción esquemática del procedimiento en el modelo de ratón con asma inducida por OVA. Los ratones se sensibilizaron a OVA (ip) los días 1, 14 y 21 y se expusieron a OVA en aerosol los días 26, 27 y 28 para inducir una inflamación alérgica aguda de las vías respiratorias. Se provocó una inflamación neutrofílica aguda mediante la instilación del ácido poli(citidílico-inosínico) ligando de TLR-3 el día 28. Un grupo de control se sensibilizó de forma simulada a PBS y se expuso a aerosol de OVA. Los ratones fueron sacrificados el día 29.
Lavado broncoalveolar
A través de una cánula traqueal, los pulmones se lavaron con 1 ml de PBS estéril enfriado con hielo que contenía inhibidor de proteasa (Complete, Roche, Basilea, Suiza). Las células obtenidas se contaron utilizando un microscopio óptico (Leica, Wetzlar, contador de células automatizado Countess; Life Technologies, Darmstadt, Alemania).
Resistencia y distensibilidad de las vías respiratorias
24 h después de la última provocación con OVA, los ratones se anestesiaron con ketamina y se bloqueó la xilazina y la actividad neuromuscular con bromuro de pancuronio (1 mg/kg) (Sigma, Deisenhofen, Alemania). Los ratones traqueostomizados fueron ventilados mecánicamente a través de una cánula traqueal conectada al sistema FinePoint R/C. El flujo de aire y la presión transpulmonar se registraron continuamente utilizando un sistema Buxco FinePoint R/C (DSI-Buxco Electronics, Sharon, CT, EE. UU.), calculando la resistencia pulmonar (cm H2O/mL/s) y distensibilidad pulmonar dinámica (mL/cm H2O) en cada ciclo de respiración.
Determinación serológica de la degradación del colágeno tipo I
La degradación del colágeno tipo I se evaluó en suero humano o de ratón mediante un ELISA validado dirigido a un neoepítopo específico de la degradación del colágeno tipo I (C1M) mediada por MMP-2,9,13 (Nordic Bioscience, Herlev, Dinamarca) [22]. Las mediciones se realizaron de manera ciega de acuerdo con las instrucciones del fabricante. C1M se evaluó previamente en suero de participantes en el estudio PERF [37].
análisis estadístico
Los datos demográficos básicos se compararon mediante la prueba U de Mann-Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis o la prueba de chi-cuadrado según corresponda después de la prueba de normalidad. Los niveles de C1M o los parámetros clínicos se compararon entre los grupos mediante la prueba de Kruskal-Wallis, la prueba U de Mann-Whitney o la correlación de rango de Spearman, según fuera apropiado. Se utilizó MedCalc Statistical Software versión 16.8.4, MedCalc Software bvba, Ostende, Bélgica para realizar todos los análisis estadísticos. La importancia de la característica con respecto a los niveles de C1M se calculó con un modelo Random Forest implementado a través de R (V. 3.5.1) con el paquete caret R (6.0.86). PAGS-valores > 0,05 se consideró significativo.
Resultados
Características de línea base
Los datos demográficos básicos de los participantes con asma grave, leve a moderada y los controles sanos del estudio ALLIANCE se enumeran en la Tabla 1. La edad, el índice de masa corporal (IMC) y los paquetes-año de consumo de cigarrillos fueron significativamente diferentes entre los tres grupos (PAGS= 0.0001, PAGS< 0,0001, y PAGS= 0,005, respectivamente). Los asmáticos graves tuvieron un número significativamente mayor de exacerbaciones y corticosteroides inhalados que los asmáticos leves a moderados (PAGS< 0,0001 y PAGS< 0,0001, respectivamente). El grupo de asmáticos graves incluía un 45% tratados con corticoides orales, mientras que ninguno fue tratado con corticoides orales en el grupo de asmáticos leves-moderados. Los datos demográficos básicos de los participantes asmáticos del estudio PERF se enumeran en el suplemento en línea e-Table 1.
0 Comments